收藏本站
收藏 | 论文排版

磷酸二酯酶-4及其亚型对β-淀粉样蛋白诱导的认知障碍及神经炎症的调节作用

王闯  
【摘要】:目的: 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种以β-淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结为重要标志物并伴随慢性神经炎症及认知功能障碍为特征的神经退行性疾病。通过抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性可能成为开发新型缓解神经损伤和减缓阿尔茨海默病进程药物的理论依据。磷酸二酯酶-4(Phosphodiesterse-4, PDE4)作为重要第二信使环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)特异性水解酶可能对脑内多种信号转导通路发挥作用。研究发现,通过抑制PDE4从而激活cAMP介导的cAMP/PKA/CREB信号转导通路,可以改善多种因素引起的认知障碍及炎性疾病。因此,本研究的目的首先通过使用β-淀粉样蛋白(Amyloid beta peptide, Aβ)的不同片段:Aβ1-42或Aβ25-35诱导的AD动物模型,明确Ap的病理作用中是否诱发神经炎症及其pCREB信号通路的下调;并使用PDE4的特异性抑制剂咯利普兰进行干预,明确PDE4抑制剂在改善动物认知功能障碍的同时是否伴随动物脑内神经炎症的改善以明确PDE4对学习记忆功能的改善是否与改善神经炎症有关;并且为进一步阐明这一问题,我们通过使用TNF-α抗体动物脑内注射,单纯通过阻断Aβ诱发的神经炎能看是否能够改善其所诱发的认知功能障碍,以期阐明神经炎症与认知功能障碍间的关系;同时我们使用脑内给予PKA的阻断剂H89以阻断PDE4抑制剂对脑内PKA/CREB信号转导通路的激活效应,看是否通过阻断pCREB介导的信号转导通路能否阻断PDE4抑制剂对认知功能与神经炎症的改善作用,明确PDE4抑制剂引起的cAMP/PKA/CREB信号转导通路与认知功能及神经炎症间的关系。其次,为进一步阐明PDE4亚型在学习记忆中的调节作用,我们首先使用PDE4A基因敲除动物对PDE4A在学习记忆功能及其该基因对神经发生的影响进行了首次研究,并进一步对PDE4A、B及D亚型基因敲除后在Ap诱导的认知功能障碍及神经炎症的调节作用,进一步阐明每种亚型在中枢神经系统的调节作用。因此本研究进一步丰富了PDE4及其亚型在AD中的调节作用,为开发高选择性及高效亚型抑制剂提供了理论依据,并为AD治疗中的抗炎理论提供了实验依据及新的观点。 方法: (1)小鼠海马CA1或DG区分别注射老化状态的Aβ1-42 (0.4、1.6μg/side),10天后分别依次进行自主活动测试记录其穿线次数及直立次数。24小时后在同一装置内进行5分钟的新物体识别实验的学习阶段,记录动物对两对称放置的相同物体的识别时间,24小时后进行新物体的识别测试,并分别记录动物对新,旧物体在5分钟内的识别时间,并计算动物对新物体的识别指数。物体识别实验后24小时,进行跳台实验的学习阶段,24小时后对动物的潜伏期进行测试。全部行为学结束后24小时,处死动物并取海马组织,采用Western bloting的方法对pCREB、CREB、BDNF、NF-κBp65、IL-1β进行检测。并且,为验证本实验手术定位的准确性,在整个实验进行前对药物能否准确微量注射进海马CA1或DG区进行了验证,我们采用GFP-标记的慢病毒,按照不同的坐标,打入CA1或DG区,14天后,切片观察病毒能否在CA1或DG区准确表达。 (2)首先,我们以空白溶剂和逆序列的Aβ1-42为对照,对ICR小鼠海马CA1区分别注射老化状态的Aβ1-42 (0.1、0.4、1.6pμg/side)。选择中间剂量行PDE4抑制剂咯利普兰进行干预。10天后动物分别进行自主活动测试、物体识别实验、跳台实验及Morris水迷宫测试。全部行为学实验结束后24小时,处死动物并取海马及前额皮层,采用免疫印迹的方法对海马及皮层内的pCREB、CREB、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65、COX-2、IL-10、SOD以及海马内Aβ1-42的含量进行测试。并对海马内PDE4A、B、D亚型和亚亚型的表达进行了检测。其次,为验证咯利普兰的量效关系,采用老化状态的Aβ25-35(10μg/side)诱导SD大鼠学习记忆障碍模型,分别采用0.1,0.25,0.5mg/kg的咯利普兰进行干预。12天后进行Morris水迷宫测试及避暗实验测试。行为学实验结束24小时后动物处死并取海马组织,免疫印迹方法测试海马内pCREB、NF-κB p65、Bcl-2及Bax的表达。最后,为验证Ap诱导的动物学习记忆障碍是否与其诱导的神经炎症相关及pCREB在炎症调节中的作用。我们使用老化状态的Aβ1-42分别微量注射进ICR小鼠海马CA1区(0.4μg/side)诱导AD动物模型,验证TNF-α抗体海马CA1区给药能否阻断动物的神经炎症,并采用PKA的阻断剂H89,通过对PKA的阻断验证能否阻断PDE4抑制剂咯利普兰的抗炎及认知增强作用。本实验所有动物手术后10天均进行自主活动测试、物体识别实验、跳台实验及Morris水迷宫测试。行为学测试结束24小时后,采用免疫印迹方法对动物海马内pCREB、CREB、NF-κB p65及TNF-α进行测试。 (3)首先采用PDE4A-/-小鼠探讨PDE4A亚型敲除后与野生型相比在学习记忆能力方面的变化及其机制。分别采用自主活动实验、物体识别实验及跳台实验比较两组动物的学习能力。采用免疫印迹方法对动物海马、皮层及纹状体内的pCREB、CREB及BDNF进行检测。并采用免疫组化的方法对新生神经元的增殖与存活能力进行比较。其次,我们采用PDE4D-/-动物,海马CA1区给予0.41μg/侧的Aβ1-42,对PDE4D在Aβ1-42诱导的学习记忆障碍与神经炎症的调节作用进行研究。手术10天后,采用自主活动实验、新物体识别实验、跳台实验及Morris水迷宫实验对动物的学习记忆能力进行测试。采用免疫印迹方法对海马内pCREB、CREB、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-10进行测试。最后,我们采用PDE4A、B、D基因敲除动物,海马DG区分别给予老化状态的Aβ1-42 (0.4μg/side),对三种亚型在Aβ1-42诱导的学习记忆障碍与神经炎症中的调节作用进行研究。手术10天后,采用自主活动实验、物体识别实验、跳台实验对动物的学习记忆能力进行检测,采用免疫印迹方法对海马内pCREB、BDNF、NF-κB p65及COX-2进行检测。 结果: (1)预实验研究发现,根据文献报道的定位坐标,均能准确定位海马CA1与DG区。研究发现海马CA1或DG区分别给予“老化”状态的Aβ1-42后,动物在自主活动实验中的穿线次数与直立次数均无显著变化。新物体识别实验研究发现,海马CA1或DG区两组剂量的Aβ1-42,均显著诱导了动物的认知指数的显著下降。跳台实验发现,CA1区给予两组剂量Aβ1-42均显著降低了其逃避潜伏期,而DG区仅仅1.6μg/侧的剂量显著降低了动物的逃避潜伏期。与行为学结果相一致,Aβ1-42两组剂量显著降低了CA1区的pCREB及BDNF的表达。而只有1.6μg/侧的剂量显著降低了DG区pCREB的表达,0.4,1.6μg/side均显著降低了DG区的BDNF表达。所有处理对动物的CREB的表达均没有显著影响。两剂量Aβ1-42均显著诱导了海马CA1及DG区的炎症反应,NF-κB p65及IL-1β均显著增高。 (2)首先研究发现,Aβ1-42(0.1,0.4和1.6μg/侧)剂量依赖性诱导动物在新物体识别实验、跳台实验及Morris水迷宫实验中认知功能的障碍,而咯利普兰(0.5mg/kg)诱导了上述作用,而各种处理效应对动物的自主活动能力无影响。并且对炎症因子的检测发现,Aβ1-42诱导了动物海马内神经炎症及氧化应激的出现,剂量依赖性地增加海马内IL-1β、TNF-α、NF-κB p65、COX-2水平,并且咯利普兰显著性降低了上述炎症相关因子的释放;对pCREB及CREB的检测发现,Aβ1-42剂量依赖性抑制了CREB的磷酸化,而咯利普兰逆转了上述效应,Aβ1-42及咯利普兰对CREB均无显著性影响;并且研究发现炎症反应轻微诱导了IL-10的生成,而咯利普兰也对IL-10的升高起部分调节作用;研究发现咯利普兰对Aβ1-42本身无降低作用,而Aβ1-42可以显著上调PDE4A5、PDE4A?、PDE4B1、PDE4B2、PDE4B3、PDE4B4、PDE4D4、PDE4D5水平。大鼠的结果同样发现,Ap的核心毒性片段Aβ25-35海马CA1区微量注射(10μg/侧)诱导了动物在Morris水迷宫中空间学习记忆的障碍及避暗实验中长时程学习记忆的障碍。并且Aβ25-35诱导海马内NF-κB p65和Bax的显著性增高及pCREB和Bcl-2的显著性降低。上述指标均被咯利普兰(0.1、0.25和0.5mg/kg)剂量依赖性地逆转。其次,研究发现TNF-α抗体尽管其阻断了炎症反应,使NF-κB p65及TNF-α显著性降低,但仅轻度缓解了动物的学习记忆能力,而TNF-α轻微加重了Ap诱导的学习记忆障碍,轻度削弱了咯利普兰的认知增强作用;而PKA阻断剂H89不仅仅阻滞咯利普兰的认知增强作用而且阻断了咯利普兰对炎症的缓解作用。 (3)研究首先发现PDE4A基因敲除动物与野生型动物相比学习记忆能力显著增强,且PDE4A基因敲除对动物的自主活动能力无显著性影响。并且该基因敲除后不仅显著上调海马内pCREB/BDNF信号转导通路,而对皮层及纹状体内该信号转导通路无显著性影响,而且使海马内神经增值与存活能力显著增强;其次研究发现PDE4D基因敲除动物能够逆转海马CA1区微量注射Aβ1-42所诱导的学习记忆障碍,并且显著性逆转了Aβ1-42对CREB磷酸化功能的抑制。尽管对NF-κB p65、TNF-α、IL-1β无显著性影响,PDE4D基因敲除却显著性抑制了Aβ1-42对COX-2的诱导作用,并且轻度增加了IL-10水平。进一步研究发现,而PDE4A与D对虽未能改善海马DG区微量注射Aβ1-42所诱导的诸如NF-κBp65的增加,其却显著性降低了Ap1-42诱导的COX-2的水平,并且显著上调pCREB/BDNF信号转导通路,起到了认知功能增强的作用;而PDE4B基因敲除虽未能显著改善Aβ1-42诱导的认知功能障碍及pCREB/BDNF信号转导通路的下调,但其显著性降低了Aβ1-42诱导的NF-κB p65的过表达,并且奇怪的是PDE4B基因敲除却未能显著降低Aβ1-42所诱导的COX-2的过表达。 结论: 本研究发现,Aβ1-42微量注射入海马CA1和DG区均能够诱导动物学习记忆功能障碍,并且伴随神经炎症的出现与pCREB/BDNF信号转导通路的下调,为寻找具有抗炎作用并伴有pCREB介导的信号转导通路增强的新的抗老年痴呆药物靶点提供了理论依据;并且研究发现PDE4抑制剂咯利普兰不仅可以逆转Aβ1-42及Aβ25-35分别诱导的动物认知功能障碍,而且可以改善Aβ注射脑区的炎症反应与凋亡反应,并上调pCREB介导的信号转导通路,为选择以PDE4为药物作用靶点奠定了理论基础,不仅对PDE4抑制剂在Aβ诱导的学习记忆障碍中的作用及机制进行了阐明,而且对Ap具有诱导PDE4不同亚亚型的高表达进行了研究,丰富了Ap对pCREB信号转导通路下调的机制并为进行PDE4A、B及D亚型在Ap诱导的学习记忆障碍中的调节作用奠定了基础。神经炎症在AD学习记忆障碍中发挥一定作用,而PDE4抑制剂通过pCREB信号转导通路在学习记忆及神经炎症中发挥重要作用。我们的研究首次明确PDE4A基因敲除具有上调pCREB信号转导通路并具有增强海马神经发生的功能,明确了PDE4A亚型具有调节认知功能的作用;进一步证明了PDE4A及D基因敲除逆转Ap诱导的学习记忆障碍的作用,并且阐明PDE4A及D对Ap诱导的神经炎症无显著改善作用,而PDE4B虽然未能显著上调pCREB信号转导通路,却显著改善了海马内神经炎症,这可能是由于PDE4A及D基因敲除后下调COX-2而PDE4B敲除后未能下调COX-2所致。说明不同部位COX-2下调可能对炎症改善并不起积极作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 袁林;朱云峰;黄琼;胡玉萍;袁德培;;固本健脑液改善小鼠学习记忆障碍的实验研究[J];湖北民族学院学报(医学版);2010年04期
2 徐永祥;刘旭;徐江平;;磷酸二酯酶4及其抑制剂在学习记忆中的作用[J];国际药学研究杂志;2007年05期
3 周伟勤;毕明刚;杜冠华;;快速老化小鼠SAMP8研究进展[J];中国药理学通报;2009年05期
4 洪茂林;张醒民;皮兴文;周娓;;寿星胶囊对小鼠学习记忆障碍的实验研究[J];中医药学刊;2006年12期
5 郭欣欣,徐秋萍;模拟老年期痴呆动物模型的研究概况[J];中药药理与临床;1998年03期
6 朱坤杰;孙建宁;;六味地黄丸对D-半乳糖所致衰老大鼠学习记忆的改善作用及机理[J];中国实验方剂学杂志;2006年08期
7 郭德玉;叶翠飞;王钜;李林;敖平;李斌;;基底前脑胆碱能神经元损毁:一种老年性痴呆方法学动物模型的复制及应用要点[J];实验动物科学与管理;2006年04期
8 刘小莉;陈虹;;阿尔茨海默病动物模型研究概况[J];山东医药;2007年11期
9 郑向红;郭景财;雷雅梅;;银杏叶制剂改善MID痴呆大鼠学习记忆障碍的实验研究[J];实用医技杂志;2006年15期
10 吴剑芸;张韶冈;徐俊;杜南进;刘丰;黄文革;;双侧颈总动脉结扎对老龄大鼠学习记忆功能的影响[J];现代医院;2006年09期
11 郭德玉;王钜;李林;李斌;;药理研究中常用学习记忆障碍动物模型的行为学分析[J];实验动物科学;2007年01期
12 徐秀梅;范英昌;冯莉;杨琳;郭茂娟;赵旭;;六味地黄丸对糖尿病大鼠影响的实验研究[J];现代中医药;2008年01期
13 刘石梅,苏南湘,何明大;血管性痴呆动物模型实验研究进展[J];中医药导报;2005年09期
14 武海霞;张丹参;张力;安芳;薛贵平;王树;;大黄酚对β-淀粉样蛋白25~35致小鼠学习记忆障碍的改善作用[J];中国老年学杂志;2009年16期
15 唐湘祁;涂秋云;雷立芳;;绿原酸对小鼠海马一氧化氮合酶神经元的保护作用[J];湖南师范大学学报(医学版);2006年02期
16 李国才;招伟贤;;复方麝香对氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆及外周血IL-6,TNF-α变化的影响[J];广东医学;2007年10期
17 贾丽君;王士超;王耀帅;王玲玲;徐斌;;隔姜灸不同灸量调节血脂的效应比较[J];中国中医药信息杂志;2011年01期
18 许静;薛梅;陈吉庆;;益气饮口服液对糖尿病大鼠免疫功能影响研究[J];现代医药卫生;2009年24期
19 韩迪;;葛根对糖尿病大鼠影响的实验研究[J];内蒙古中医药;2010年08期
20 王敬卿,李锐,陈松盛,郑清莲;醒脑胶囊对多发脑梗塞致学习记忆障碍的影响及其机理研究[J];西安医科大学学报(中文版);1999年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王闯;卓烨烨;周恒;林焕冰;程玉芳;徐江平;;咯利普兰对Aβ25-35诱导的大鼠学习记忆障碍的影响及机制[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
2 王闯;程玉芳;张汉霆;徐江平;;磷酸二酯酶-4A、B及D亚型在Aβ1-42诱导的学习记忆障碍中的调节作用及机制[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
3 陈锐;李建祥;刘建芳;李振华;刘春风;;慢性间歇低氧动物模型的建立及低氧诱导小鼠学习记忆障碍[A];中华医学会第七届全国哮喘学术会议暨中国哮喘联盟第三次大会论文汇编[C];2010年
4 李昌煜;郭建友;;抑郁症动物模型研究进展[A];中国药理学会第八次全国代表大会论文摘要集(第二部分)[C];2002年
5 蒋灿华;叶冬霞;陈万涛;林国础;张志愿;邱蔚六;;舌鳞癌SD大鼠动物模型的建立[A];2004年口腔颌面肿瘤基础研究学术研讨会会议日程及论文集[C];2004年
6 谢瑶;卢昕;王国春;郭健;陈旺;王泰玲;;实验性肌炎动物模型的建立及其治疗的研究[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年
7 李丽霞;汤永民;沈红强;钱柏芹;罗春芳;张海忠;;急性B淋巴细胞系白血病靶向治疗动物模型的建立[A];中国抗癌协会第七届全国小儿肿瘤学术会议论文汇编[C];2007年
8 闫慧博;鲁凯伍;金大地;江建明;;建立稳定的大鼠脊髓全横断模型的实验研究[A];第八届全国脊柱脊髓损伤学术会议论文汇编[C];2007年
9 柴玮杰;王玉燕;高珉之;王瑞翀;王明秋;;建立三聚氰胺致大鼠肾损伤模型的研究[A];中国毒理学会第五次全国学术大会论文集[C];2009年
10 李翠娟;孙理军;;对基于体质的中医证候动物模型制作的思考[A];中华中医药学会第七届中医体质学术研讨会论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王闯;磷酸二酯酶-4及其亚型对β-淀粉样蛋白诱导的认知障碍及神经炎症的调节作用[D];南方医科大学;2011年
2 程玉芳;磷酸二酯酶-4(PDE4)对Alzheimer's病认知障碍的调节作用及其机制研究[D];南方医科大学;2010年
3 冯书章;A/E大肠杆菌疫苗动物模型的研究:兔大肠杆菌基因工程疫苗[D];中国人民解放军军需大学;2001年
4 石文静;吸氧和血管生长因子在新生小鼠视网膜病发病中的作用[D];复旦大学;2004年
5 佡剑非;Aβ-AD动物模型建立及NGF治疗的实验研究[D];中国医科大学;2005年
6 胡萍;透镜诱导豚鼠眼屈光状态的改变及豚鼠近视眼巩膜中MMP-2、TIMP-2和生长因子变化的研究[D];山东大学;2004年
7 许亦权;同种异体骨移植修复犬颞颌关节、下颌骨缺损的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年
8 刘庆华;老年人呼吸机相关肺炎综合干预和发病机制的临床和实验研究[D];复旦大学;2005年
9 王小元;严重联合免疫缺陷小鼠子宫内膜异位症模型的建立及其免疫重建的研究[D];山东大学;2005年
10 邵世坤;创伤性骨关节炎发病机理和初步防治的研究[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙玉芳;不良心理应激对小鼠卵巢功能的影响及金水宝的调节作用[D];南昌大学;2009年
2 张丽;轻微肝性脑病大鼠海马内Glu、GluR1、GABA及GABAR_A表达的实验研究[D];山西医科大学;2005年
3 王骏;心肌缺血日负荷对兔VEGF表达的影响[D];南京医科大学;2005年
4 金晓颖;伏九贴敷疗法对致敏豚鼠肺泡灌洗液MC及肺组织形态学影响的研究[D];辽宁中医学院;2005年
5 张国鹏;动物血液与腹部内出血模型的阻抗特性基础研究[D];第四军医大学;2005年
6 田明霞;暴露性干眼症动物模型的制作及其发病机制的研究[D];青岛大学;2005年
7 李彦;兔下颌骨牵张成骨对肌间结缔组织及神经的影响[D];第四军医大学;2005年
8 葛良鹏;大鼠糖尿病溃疡模型的制备及其生物学特性的初步研究[D];西南师范大学;2005年
9 刘小会;醛糖还原酶抑制剂对大鼠肾脏醛糖还原酶基因表达的影响[D];天津医科大学;2005年
10 丁澄;精神分裂症动物模型的拓展及在相关基因和药物筛选中的应用[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 赵喜明;鄂建立早老性痴呆症动物模型[N];中国医药报;2004年
2 张超群 范晓莉;山西医大制作成功免疫性不育动物模型[N];中国医药报;2005年
3 ;我国建立首个SARS感染动物模型[N];中国高新技术产业导报;2003年
4 记者 陈勇;美国科学家成功让鼠脑中长出人脑细胞[N];新华每日电讯;2005年
5 裘 索;中医药现代化若干问题的思考[N];中国中医药报;2004年
6 王世恩 特约记者 王坤;四医大建立基因剔除动物模型[N];解放军报;2000年
7 张超群 范晓莉;建立膀胱肿瘤免疫治疗动物模型[N];中国医药报;2005年
8 何卉 陈西敬 王广基;基因缺陷动物模型促进药物跨膜转运研究[N];中国医药报;2006年
9 徐亚静;上海两项自然科学基金项目通过鉴定[N];中国医药报;2005年
10 特约记者 曾利明;我国成功建立非典病毒动物模型[N];中国改革报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978