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臭氧对兔膝骨关节炎的作用及机制研究

林庆荣  
【摘要】:一、研究背景 随着人类平均寿命的延长以及世界范围内人口老龄化,骨关节炎的发病率逐年增高,已成为家庭和社会的巨大负担:对骨关节炎的发病机制及防治研究,直是医学界的一个热点。 骨关节炎的具体发病机制尚未完全阐明,目前认为是由多种因素相互作用而形成的。治疗骨关节炎的目标就是解除患者疼痛,改善关节功能,从而提高其生活质量。预防保健是最简便而且有效的方法;其它治疗手段如口服药物、关节腔注射等,主要缓解患者的疼痛从而部分恢复关节的功能,病情易反复,也容易产生一定的副作用,增加消化系统、心血管系统疾病的风险;目前公认较为彻底的治疗方法就是人工关节置换,但其费用昂贵、有一定的使用年限且存在一定的手术风险,并不适合我国国情。 臭氧能够用于治疗疼痛,且止痛效果较传统的激素+局麻药的效果好,副作用远远小于类固醇激素,所以国内外逐渐将臭氧应用于骨关节炎的治疗。在缓解疼痛方面,取得了较好的效果。但在臭氧治疗骨关节炎的研究上,基础研究远远落后于临床实践,这极大的制约了骨关节炎臭氧疗法的应用及推广。 目前臭氧疗法的相关研究集中于臭氧在血液中的作用及机制,尚未涉及臭氧作用于关节时对软骨、滑膜细胞的影响。血液中有强大的缓冲系统,也有各种抗氧化物质,臭氧氧化损伤的可能性较小;而关节腔中本来就是低氧环境,软骨细胞没有直接的血液供应,因此,直接把臭氧在血液中的作用及其机制直接生搬硬套过来,显然是不科学的。 而且国内外使用臭氧治疗骨关节炎,各家使用臭氧的浓度、剂量、周期及频率各不相同。臭氧作为一种强氧化物质,使用过量必然会造成组织结构的损伤。那么,臭氧在骨关节炎中的作用究竟如何?临床治疗的时候,应该使用怎样的臭氧浓度?其治疗的频率、频次应该多少,才能既取得良好效果,又能最大程度避免其副作用呢? 二、研究目的 1.研究不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎中软骨及滑膜的影响及其规律。 2.研究不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎作用的机制:通过研究不同浓度臭氧对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响,来确定其作用途径和机制;并探讨使用何种浓度的臭氧更适合于兔膝骨关节炎的治疗。 3.研究不同次数臭氧注射对兔膝骨关节炎中软骨及滑膜的影响,观察不同次数的臭氧对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响及其规律。 4.研究不同次数臭氧注射对兔正常膝关节中软骨及滑膜的影响,并观察其对炎性介质IL-1、TNF-α及MMP-13的影响,探讨臭氧注射是否具有累积效应。 5.结合IL-1β及NF-κB抑制剂,研究臭氧对软骨细胞培养的影响及其机制。 6.提出臭氧治疗兔膝骨关节炎的治疗方案,为制定临床骨关节炎臭氧疗法的标准化治疗方案提供更多科学依据。 三、研究方法 (一)不同浓度臭氧对兔膝骨关节炎的影响 1.动物模型建立: 为了不干扰兔膝关节的内环境,使用关节外造模的方法,即兔膝关节屈曲位管形石膏固定术固定6周,来建立兔膝关节骨关节炎模型。 2.臭氧浓度的确定: 临床上常用的臭氧浓度最高一般不超过60μg/ml,通常为20μg/ml-40μg/ml。本实验所用臭氧发生器为德国赫美斯臭氧治疗仪(Germany Humares公司),其能产生的最大臭氧浓度为55μg/ml,因此,实验中将臭氧浓度设为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml及50μg/ml的等差浓度,以求能更精确的显示各个浓度等级的臭氧对关节组织结构的影响。 3.动物分组: 根据所使用臭氧浓度的不同,将实验动物分为正常组、模型组、纯氧组及5个臭氧组:臭氧10μg/ml组、臭氧20μg/ml组、臭氧30μg/ml组、臭氧40μg/ml组及臭氧50μ/ml组。正常组不予任何干预,模型组仅造模不予其它干预,纯氧组造模后在膝关节腔中注入医用纯氧2ml,5个臭氧组造模后分别在膝关节腔中注入相应浓度的臭氧2ml,所有注射频率均为1次/周,共3次。 4.病理切片检查及Mankin评分: 软骨标本经过脱钙、石蜡包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,根据Mankin评分标准对软骨表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个指标进行评分,每个指标均为0-3分,总分为各个指标得分相加。总分0分为正常,12分最高,分数越高损伤越严重。滑膜标本经过石蜡包埋、切片、HE染色后制作成病理切片,观察滑膜组织是否完整、有无增生、是否有炎性细胞浸入、是否有细胞凋亡或坏死等,评价不同浓度臭氧对滑膜的影响。 5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测 使用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法。已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。分别将IL-1、TNF-a及MMP-13和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中IL-1 TNF-a及MMP-13的浓度呈比例关系,用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 6.数据统计分析: 数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析8组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果8组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。 IL-1、TNF-α及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls (SNK)法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧浓度与IL-1、TNF-α及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。 检验水准为a=0.05,P_0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差(x±s)表示。 (二)不同次数臭氧注射对兔膝骨关节炎的影响 1.动物模型的建立: 新西兰大白兔仅右侧膝关节进行骨关节炎造模,动物模型建立的方法同上所述。 2.臭氧浓度的确定: 前述实验的结果提示臭氧作用于兔膝骨关节炎的最佳浓度为20μg/ml,所以本实验部分使用的臭氧浓度为20μg/ml。 3.动物分组: 根据臭氧注射次数的不同分为4组:0次组、1次组、3次组、5次组,分别接受0次(即仅穿刺不进行臭氧注射)、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的浓度为20μg/ml,进行多次注射时,注射间隔为1周。 4.病理切片检查及Mankin评分: 同前所述,制作成切片后从表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个方面进行Mankin评分,0分为正常,12分最高,分数越高软骨损伤越严重。 5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测: 同前所述,采用组织匀浆后进行ELISA法检测。 6.数据统计分析: 数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析4组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果4组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。 IL-1、TNF-α及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls (SNK)法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次数与IL-1、TNF-α及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。 检验水准为a=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差G±s)表示。 (三)不同次数臭氧对兔正常膝关节的影响 1.动物模型的建立: 本实验部分选用兔正常膝关节,不需要造模。 2.臭氧浓度的确定: 本实验部分使用的臭氧浓度为20μg/ml。 3.动物分组: 根据臭氧注射次数的不同分为4组:0次组、1次组、3次组、5次组,分别接受0次(即仅穿刺不进行臭氧注射)、1次、3次及5次臭氧注射。臭氧注射的浓度为20μg/ml,进行多次注射时,注射间隔为1周。 4.病理切片检查及Mankin评分: 同前所述,制作成切片后从表面结构、细胞数量、细胞克隆及基质染色4个方面进行Mankin评分,0分为正常,12分最高,分数越高软骨损伤越严重。 5.软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-a及MMP-13的检测: 同前所述,采用组织匀浆后进行ELISA法检测。 6.数据统计分析: 数据统计使用SPSS13.0软件,软骨Mankin评分结果为有序分类变量,使用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验,从总体上分析4组之间有无差别。经Kruskal-Wallis H检验后,如果4组之间差别有统计学意义则进行组间多重比较的Nemenyi检验。 IL-1、TNF-a及MMP-13的检测结果应用one-way ANOVA进行分析,多组均数多重比较方差齐性时采用Student-Newman-Keuls (SNK)法,方差不齐时采用Dunnett T3法。不同臭氧注射次数与IL-1、TNF-a及MMP-13表达之间的相关关系采用Spearman相关分析。 检验水准为a=0.05,P0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。结果以均数±标准差G±s)表示。 (四)臭氧对兔软骨细胞培养的影响 1.软骨细胞的取材、分离及培养 取体重2-2.5kg的新西兰大白兔(雌雄不限),耳缘静脉注射空气处死,常规备皮、消毒、铺巾,无菌条件下剪开皮肤,咬骨钳取出关节,无菌手术刀片削取厚度约0.1~0.2mm的软骨,放入盛有PBS液的培养皿中,剪碎,移入25ml培养瓶中,用PBS液清洗软骨块两次,去除残余血迹,加入0.1%Ⅱ型胶原酶2ml消化20分钟,轻轻吹打后弃去上清,并重复1次;再加入0.1%Ⅱ型胶原酶5ml,37℃下震荡消化6-8小时,1500r/min离心3分钟使细胞沉淀,弃消化液后清,用培养液清洗三次,以洗去细胞表面的消化酶;重悬成细胞混悬液。无菌200目滤网过滤细胞混悬液后,计数。 按5×105/孔的密度将细胞混悬液接种于6孔板中,培养液选用低糖DMEM、20%胎牛血清、1%(v/v)双抗、0.69mM抗坏血酸及2mM左旋谷氨酰胺,缓冲液选用HEPES。将6孔板置于PCO25%的孵箱中培养72小时。显微镜下显示大部分细胞贴壁牢固并且生长成亚融合状态后,给予干预。 2.实验分组: 试验分成A-F六组:其中A表示空白对照组(normal),B代表NF-κB抑制剂组(NF-I), C表示臭氧组(03),D表示IL-1β组(IL),E表示IL-1β+NF-κB抑制剂组(IL+NF-I), F表示IL-1β+臭氧组(IL+03)。每组样本量为5个。 根据预实验的结果,使用臭氧浓度为20μg/ml,加入臭氧的量为0.5ml,即每个培养孔加入的臭氧剂量为10μg。NF-κB抑制剂的浓度稀释为100μg/ml,每孔加入100gL,即10μg/孔。IL-1β的浓度为100ng/ml,每孔加入100μL,即10ng/孔 3.干预及不同时间点培养液的获取 将6孔培养板置于PC025%的孵箱中培养72小时。显微镜下显示大部分细胞贴壁牢固并且生长成亚融合状态后,准备给予干预。首先弃6孔培养板中原有培养液,并在每个孔中添加1000μL新培养液,在B组、E组对应培养孔中添加浓度为100μg/ml的NF-κB抑制剂1001μL,在D组、E组、F组对应培养孔中添加浓度为100ng/m的IL-1β100μL;随后将每个培养孔中培养液的总量添加至2000μL;接着在C组、F组对应孔中注射浓度为20μg/ml的臭氧0.5ml,从获取臭氧到注射之间的间隔控制在15s以内,整个注射的过程不少于lmin,且注射器针头始终处于相应培养孔培养液的下方。 所有干预完成后,在5分钟内每个孔取500μL的培养液,置于冻存管中-20℃保存;24h后每个孔再取500μL的培养液,同样置于冻存管中-20℃保存;48h后,将个孔剩余培养液置于冻存管中-20℃保存。同时更换新培养液,不再予以其它干预,软骨细胞待检测。 4.观察内容和检测指标 检测0h、24h、48h三个不同时间点各组上清液中T-SOD、MDA、NO、iNOS的含量,采用免疫组化方法观察各组软骨细胞NF-κB、COX-2的表达,WesternBlot检测软骨细胞NF-κB的表达,流式检测各组软骨细胞的凋亡情况。 5.统计学处理 结果用SPSS 13.0统计软件,培养液T-SOD、MDA、iNOS、NO不同时间点的检测使用重复测量方差分析,其它数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),若经Levene检验,数据满足方差齐性,用SNK法对各组数据进行多重比较;数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Dunnett T3法进行统计分析,结果用:x±s表示,p0.05表示有显著性差异。 四、研究结果 1.不同浓度的臭氧对软骨的作用各异,浓度与效应有相关性 在实验中可观察到,不同浓度的臭氧可加重或减轻兔膝骨关节炎中软骨的损伤。软骨损伤程度的判断通常使用Mankin评分,0分为正常,分数越高损伤越严重。各组软骨细胞的Mankin评分由高到低分别为:臭氧50μg/ml组(7.8分)模型组(6.8分)及纯氧组(6.8分)臭氧40μg/ml组(5.4分)臭氧30μg/ml组(4.6分)臭氧10μg/ml组(4.4分)臭氧20μg/ml组(3.4分)正常组(0.2分)。提示臭氧浓度从10μg/ml到20μg/ml升高的过程中,减轻骨关节炎软骨细胞损伤的能力增强,而在20μg/ml到50μg/ml的范围内,随着臭氧浓度的增高,软骨细胞的损伤程度加重,到达50μg/ml时,其损伤程度高于模型组,这个时候不仅不能起到治疗的作用,反而加重关节软骨的损伤。 2.臭氧对滑膜增生有明显的抑制作用且具有浓度-效应相关性 在注射臭氧的组别中,兔膝关节滑膜的数量远远少于模型组及纯氧组,也少于正常组;并且随臭氧浓度的增加,滑膜减少越来越明显。提示臭氧能够抑制滑膜的增生,臭氧的浓度越高,其抑制作用越强。光镜下,模型组及纯氧组的滑膜组织增生明显,正常组滑膜细胞数量、排列正常,而臭氧各组随着浓度的增加,滑膜细胞增生程度逐渐减少,滑膜组织完整性逐渐丧失,到40μg/ml及以上浓度时,滑膜细胞数量较正常明显减少,外层滑膜结构完整性丧失。提示越高浓度的臭氧,对滑膜组织的氧化损伤程度越重。 3.软骨、滑膜组织中三种炎性介质表达的变化 臭氧注射进关节腔以后,能引起软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质表达程度的改变,且其变化趋势较一致,在软骨及滑膜组织中表达情况也较一致,由高到低均为:臭氧50μg/ml组纯氧组和模型组臭氧40μg/ml组臭氧10μg/ml组和臭氧30μg/ml组臭氧50μg/ml组正常组。臭氧浓度在40μg/ml的范围内,三种炎性介质在软骨和滑膜中的表达均呈“U”形分布,在20μg/ml以上时,随着浓度的增高,三种炎性介质的表达均明显升高,达到50μg/ml时,其表达超过模型组及纯氧组(50μg/ml组与模型组及纯氧组之间两两比较均为P=0.000)。提示浓度为50μg/ml的臭氧可明显加重关节组织的损伤。这与软骨、滑膜光镜下的表现一致。 4.不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨及滑膜的影响各异 为了观察臭氧的注射次数会对关节造成何种影响,进行了不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨、滑膜作用的研究。实验结果显示,不同次数的臭氧注射后,对软骨组织的影响各异,Mankin评分由高到低分别为0次组(6.75分)和5次组(6.75分)1次组(4.63分)3次组(3.38分),但1次组和3次组之间比较无显著性差异(P=0.32)。提示注射臭氧可一定程度上减轻软骨组织的损伤,但注射次数大于等于5次时,可能无法起到治疗的作用,甚至会加重软骨组织的损伤。随着臭氧注射次数的增加,滑膜组织的数量越来越少,5次组的滑膜数量明显减少以致获取有一定的难度。 软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质表达程度的变化趋势较一致,在软骨及滑膜组织中表达情况也较一致,由高到低均为:0次组5次组1次组3次组。提示注射臭氧的次数在3次或以内时,可在一定程度上减轻兔膝骨关节炎的损伤,而当注射的次数达到或超过5次时,可能不仅得不到治疗效果,反而造成关节损伤程度的加重。 5.不同次数臭氧对兔正常膝关节软骨及滑膜造成影响且存在次数-效应相关性 为了比较不同次数臭氧关节腔注射的安全性,评价两次臭氧注射间隔设定为1周的合理性,观察不同次数臭氧注射对兔正常膝关节软骨、滑膜的影响,实验结果显示,不同次数的臭氧注射后,对软骨组织的影响各异,Mankin评分由高到低分别为5次组(3.75分)和3次组(2.38分)1次组(1.38分)0次组(0.13分)。提示注射20μg/ml的臭氧会对正常膝关节中的软骨组织造成一定的损伤,且随着注射次数的增加,损伤程度逐渐加重。随着臭氧注射次数的增加,滑膜组织的数量越来越少,5次组的滑膜数量明显减少以致获取有一定的难度。 软骨、滑膜组织中IL-1、TNF-α及MMP-13这三种炎性介质在软骨及滑膜组织中表达的趋势一致,均随着注射臭氧次数的增多而增高。提示在正常关节腔中注射浓度为20μg/ml的臭氧,会对软骨、滑膜组织造成一定的损伤,且该损伤具有一定的累积效应,在注射间隔为1周时,注射的次数越多,造成的损伤越严重。 6.臭氧对软骨细胞的培养有影响 在IL-1p存在的情况下, NF-κB抑制剂及臭氧均能抑制NF-κB的表达, NF-κB抑制剂的抑制作用明显强于臭氧;臭氧可以明显减少由IL-1β引起的软骨细胞凋亡及坏死;臭氧可以提高软骨细胞培养液中T-SOD的含量、降低MDA的水平,也能在一定程度上降低iNOS及NO的水平。 五、结论 1.较低浓度的臭氧可能可以延缓骨关节炎病程的进展,而较高浓度的臭氧能加重关节的损伤。不同浓度臭氧在同样进行3次关节腔内注射时,20μg/ml的臭氧效果最佳。 2.不同次数臭氧对兔膝骨关节炎软骨及滑膜的影响各异,注射臭氧的次数在3次时,能最大程度减轻兔膝骨关节炎的损伤,而当注射的次数达到5次时,反而加重关节损伤的程度。在使用臭氧治疗骨关节炎时,要注意臭氧注射的总次数,必要时适当降低臭氧注射的频次,以避免加重关节的损伤。 3.臭氧注射进兔正常膝关节时,会造成一定程度的软骨、滑膜组织损伤,随着臭氧注射次数的增加,损伤加重。臭氧注射进关节腔后会在短时间内有一定的累积效应,使用臭氧治疗骨关节炎时应适当延长两次治疗间的间隔时间。 4.在IL-1β存在的情况下,臭氧能轻度抑制NF-κB的表达,可以明显减少由IL-1β引起的软骨细胞凋亡及坏死,可以提高软骨细胞培养液中T-SOD的含量、降低MDA的水平,也能在一定程度上降低iNOS及NO的水平。 5.利用臭氧关节腔注射的方法治疗骨关节炎时,应该遵循“低浓度、少频次、长间隔”的原则。


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3 ;肥胖者为何易患膝骨关节炎[N];大众卫生报;2001年
4 北京中医医院副主任医师 王玉明;中老年人如何防治膝骨关节炎[N];中国老年报;2004年
5 ;治疗膝骨关节炎的疗效比较[N];医药经济报;2002年
6 王玉明;中老年女性易患膝骨关节炎[N];贵州政协报;2002年
7 卫生部中日友好医院疼痛科主任 樊碧发;护膝 需学会止痛[N];健康报;2008年
8 上海中医药大学针推学院 王丽祯;艾灸疗法与膝骨关节炎[N];上海中医药报;2010年
9 记者 王素芹;“臭氧水”来者不善[N];中国信息报;2000年
10 保健时报特约记者 方序;体外“养”一块软骨补膝盖[N];保健时报;2011年
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