收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抑癌基因PTEN对肝癌细胞的放射增敏作用研究

张勇  
【摘要】:研究目的和意义: 原发性肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病每年约62万例,男女之比为4:1。在我国肝癌发病人数占世界每年新发病患者的55%,居我国癌症发病率的第二位,每年有13万人死于肝癌。在恶性肿瘤中,肝癌是一种生存期较短、死亡率较高、治疗很困难的恶性疾病,提高对肝癌的治疗水平具有十分重要的意义。虽然外科手术是原发性肝癌首选治疗方法,但手术率仅有5%-20%左右,同时手术复发率很高。多数肝癌患者就诊已属中晚期,此类患者能手术切除者仅占30%左右,不能手术切除的原发性肝癌的治疗方法很多,包括肝动脉插管栓塞化疗、病灶局部注射无水酒精、冷冻治疗、瘤体内射频高温治疗和体外超声波聚焦治疗等局部消融治疗都取得了一定的疗效。 放射治疗与外科有类似之处,属于局部区域性治疗手段。随着放射治疗技术的进步,适形放疗已逐渐成为非手术治疗肝癌的主要治疗方法之一。然而,放疗的临床治疗效果并不满意。肿瘤组织的放射抵抗是肿瘤放射治疗失败的原因之一,由于肝癌细胞的相对辐射抗拒性,使得肝癌的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量,尤其中晚期肝癌患者多数有肝病基础,又限制了放疗剂量的提高,导致肝癌放疗效果不佳。因此,寻找有效的、专一针对肿瘤组织的放射增敏办法对提高肿瘤组织的放疗敏感性,降低肿瘤组织的放疗抵抗,减低周围正常组织的放疗毒副作用具有重要意义,可为提高肝癌的放射治疗效果提供新的思路和途径。 随着分子生物学的研究发展,越来越多的人认识到恶性肿瘤的发生是一种涉及多基因事件的过程。肿瘤的基因治疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点之一,但临床应用效果并不令人满意。同时,分子生物学的发展也为肿瘤放射治疗提供了分子水平的理论依据,指出其杀伤作用的产生有赖于一系列基因功能的正常发挥。为了弥补各自的缺陷和不足,放射治疗与肿瘤基因治疗在自身发展的同时,正在有效地结合起来,以基因治疗靶向性处理肿瘤细胞,提高其对放射线的敏感性,然后联合放疗,有的学者将这种新的治疗模式称为肿瘤的基因-放射治疗(genetic radiotherapy).肿瘤的基因-放射治疗是指将同时具有肿瘤治疗和辐射诱导特性的基因转入体内,在对肿瘤实施局部放疗时诱导肿瘤治疗基因的表达,造成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。这样一方面可以相对降低等效照射剂量,缓解正常组织损伤;另一方面也可在即使是基因进入体内后均匀分布的情况下,通过射线的局部照射来实现定位表达。因此,将肿瘤的放射治疗与基因治疗相结合,可以解决两者单独应用时各自存在的敏感性和特异性问题。目前,初步的实验研究表明,基因-放射治疗具有提高肿瘤治疗基因的局部表达量、降低有效照射剂量、减轻受照部位正常组织的放射损伤等诸多优点。治疗基因的选择是实现此方案的关键,因此开展新的治疗基因的研究是当前恶性肿瘤基因-放射治疗的研究重点之一。 PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,被认为是继pRb、p53后的又一重要的肿瘤抑制基因,与多种肿瘤发生、发展密切相关,因此备受关注。PTEN是一种多功能性的蛋白,具有两种磷酸酶的活性:一种是脂质磷酸酶活性,使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸去磷酸化,调节第二信使PIP3的水平,阻断了PI3K/AKT途径,参与调节细胞生长、增殖和凋亡,抑制肿瘤生长,诱导肿瘤细胞分化;另一种是蛋白酪氨酸磷酸酶活性,通过靶向于FAK和Shc的蛋白质酪氨酸磷酸酶功能抑制了Ras/Raf/MEK/ERK通路的级联反应和FAK级联反应,影响细胞和细胞间质的相互作用,参与调节细胞粘连、迁移、肿瘤细胞的转移、细胞骨架的组建及MAP kinase的活化和肿瘤血管的形成。在原发性肝细胞癌的研究中,已证实PTEN基因的表达缺失与HCC的发生发展密切相关,且PTEN基因可有效抑制肿瘤细胞的生长。在肝癌细胞系中恢复PTEN的表达,细胞生长受到明显抑制。尽管目前将PTEN基因引入原发性肝癌的放射治疗在国内外尚未见报道,但在对其他多种肿瘤的研究中已发现,PTEN可以增加多种肿瘤细胞的辐射敏感性:在前列腺癌细胞、胶质瘤细胞、结肠癌细胞以及非小细胞肺癌细胞中均发现增加PTEN的表达可以增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用。因此,PTEN强抑癌功能及对肿瘤细胞的放射增敏功能可被引入肝癌的基因治疗,通过转基因技术恢复肝癌细胞中缺失表达的野生型PTEN基因,发挥正常PTEN基因的抑癌功能,同时增强对肝癌细胞的放射杀伤作用。 基于肿瘤基因-放射治疗的设想,本研究将具有辐射诱导作用的Egr-1基因启动子辐射诱导增强区域与抑癌基因PTEN相连接,构建辐射诱导表达载体,探讨含PTEN的辐射诱导表达载体稳定转染肝癌细胞系SMMC-7721后,对肝癌细胞的辐射增敏作用及其机制。 本研究采用辐射诱导基因调控序列偶联不具备辐射诱导特性的抑癌基因,通过放射线照射调控抑癌基因的表达,这一治疗手段不仅非常有特色,并且可以解决单纯基因治疗存在的特异性不强的问题,从技术手段来讲,对肿瘤放疗研究方面是一次较新的尝试。同时本研究选择抑癌基因PTEN为基因治疗靶点,PTEN基因是目前研究较明确的、具有多途径抑癌作用的强效抑癌基因,目前将PTEN基因引入原发性肝癌的放射治疗在国内外尚未见报道,从治疗基因的选择方面,选择联合PTEN来增强肝癌细胞的放疗敏感性既是对肝癌放疗增敏研究的全新尝试,也是非常可行的研究。另外,研究从肿瘤的放射增敏的分子机制入手,探讨联合PTEN进行放射治疗肝癌细胞的可能机制,丰富了肿瘤基因-放射治疗的理论依据。 目前,由于原发性肝癌的治疗效果有限,放射治疗作为非手术治疗患者的首选方法存在相对辐射抵抗性强的问题而限制了其应用,严重影响了肝癌患者的生存质量。本研究的实施将为原发性肝癌的放射治疗提供新的理论和实践视角,在解决肿瘤放射性抵抗问题上起到一定的推动作用,为今后原发性肝癌的基因-放射治疗应用于临床实践提供理论和实践支持。 方法: 分别构建含野生型PTEN和丧失了脂质磷酸酶活性的突变型PTEN的重组辐射诱导质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E,通过荧光素酶报告实验鉴定X线照射对Egr-1启动子活性的影响,寻求最适的照射条件。将构建好的重组质粒分别稳定转染入人肝癌细胞系SMMC-7721细胞,通过Western—blot法检测X线照射对PTEN蛋白表达的影响;MTT实验检测基因稳定转染SMMC-7721细胞后对细胞生长的影响;通过平板克隆实验计数克隆形成数并计算存活分数(SF),利用GraphPad Prism 5软件分别根据线性二次(L-Q)模型和多靶单击模型,得到放射生物学参数并评价转染PTEN基因后对肝癌细胞SMMC-7721细胞的辐射增敏作用;流式细胞仪检测转染PTEN基因后细胞接受X线照射前后细胞周期的变化;TUNEL检测法通过流式细胞仪检测转染PTEN基因并接受X线照射后细胞的凋亡情况;通过免疫荧光法检测细胞在接受8 Gy的X线照射后,于0、7min、1h、2h、4h、6h、12h、24h时细胞的γ-H2AX焦点形成数,进而观察肝癌细胞系SMMC-7721细胞在接受X线照射后的DNA损伤、修复情况。通过Western—blot法检测转染野生型PTEN、突变型PTEN细胞接受照射后总Akt和磷酸化Akt的表达变化,进一步采用PI3K抑制剂LY294002作用于肝癌细胞系SMMC-7721细胞,MTT检测观察应用PI3K抑制剂对受照细胞生长的影响,平板克隆实验计算存活分数,利用GraphPad Prism 5软件分别根据线性二次(L-Q)模型和多靶单击模型,得到放射生物学参数并评价PI3K抑制剂LY294002对SMMC-7721细胞的辐射增敏作用;流式细胞仪检测应用LY294002后细胞接受X线照射前后细胞周期的变化;应用流式细胞仪采用TUNEL法检测应用LY294002并接受X线照射后细胞的凋亡情况;通过免疫荧光法检测LY294002处理细胞在接受8 Gy的X线照射后,不同时间点细胞的γ-H2AX焦点形成数,观察细胞在接受X线照射后的DNA损伤、修复情况,并与转染野生型PTEN细胞组进行比较。 结果: 1、分别构建出含野生型PTEN和丧失了脂质磷酸酶活性的突变型PTEN的重组辐射诱导质粒pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E; 2、通过荧光素酶报告实验验证了辐射对所构建的Egr-1启动子区具有一定的诱导表达作用,同时,也寻找到了对SMMC-7721细胞进行照射的最适条件,即细胞转染24小时后,对细胞进行8 Gy的X线照射并于照射后24小时收集细胞进行后续的实验研究; 3、Western—blot检测表明转染了pEgr-PTEN和pEgr-PTEN-G129E的SMMC-7721细胞组在未接受照射(0 Gy)时PTEN蛋白的表达量极低,仅见微弱表达,但在接受8 Gy的X线照射后,PTEN蛋白的表达量明显提高,高于转染了pEGFP-PTEN和pEGFP-PTEN-G129E的细胞; 4、MTT检测结果表明转染野生型PTEN组细胞在接受了8 Gy的X线照射后,细胞的生长明显较接受了同样剂量的X线照射后的转染空载体pEgr-C1组与转染重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组细胞增殖速度慢; 5、转染了野生型PTEN组细胞SF2值(即接受2Gy照射后的细胞存活分数)、D0、Dq值均低于转染突变性PTEN组和未转染PTEN而仅转染了空质粒组细胞,而α值、α/β值均高于转染突变性PTEN组和未转染PTEN而仅转染了空质粒组细胞,表明转染了野生型PTEN组的细胞对X线照射的敏感性提高; 6、接受8 Gy的X线照射后,转染了野生型PTEN组细胞G2/M期细胞比例明显提高,出现了明显的G2/M期阻滞; 7、细胞接受照射24小时后,就已经有凋亡的出现,且转染野生型PTEN组细胞在接受8 Gy的X线照射后细胞凋亡率较转染空载体pEgr-C1组细胞和转染重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组的细胞凋亡率明显提高,照射后48小时各组细胞在接受X线照射后凋亡率进一步提高,但转染野生型PTEN组细胞在接受X线照射后48小时细胞凋亡率提升最为明显,远较另两组细胞的凋亡率明显提高; 8、各组细胞在受到辐射作用后7min均出现DNA双链断裂的发生,随着照射后时间的延长,DNA双链断裂形成的γ-H2AX焦点数逐渐减少,损伤的DNA双链逐渐修复,但在转染了野生型PTEN组、重组突变质粒pEgr-PTEN-G129E组和空载体pEgr-C1组细胞间DNA双链修复却不尽相同:转染野生型PTEN组细胞较另两组细胞受X线照射后,在相同时间点具有更多的未修复的DNA断裂双链,DNA修复能力降低,出现延迟现象; 9、Western-blot检测细胞中Total-Akt和磷酸化的Akt (Ser-473)蛋白的表达结果发现,转染野生型PTEN细胞磷酸化的Akt蛋白表达明显减少,细胞中Akt蛋白的磷酸化水平受到抑制,负性调节了PI3K/PTP3/AKT转导通路; 10、采用PI3K抑制剂LY294002作用于肝癌细胞系SMMC-7721细胞,发现,与转染野生型PTEN组相似,LY294002处理组细胞磷酸化的Akt蛋白表达明显减少,MTT检测和平板克隆实验结果表明应用了PI3K抑制剂LY294002处理后的细胞在接受X线照射后细胞的生长受到一定的抑制作用、可一定程度地提高SMMC-7721细胞的放射敏感性。其对SMMC-7721细胞的辐射增敏作用也同转染野生型PTEN组细胞相似:PI3K抑制剂LY294002处理后的细胞在接受X线照射后也产生了明显的G2/M期阻滞,细胞的凋亡率明显提高,LY294002处理的细胞在受到辐射作用后也出现了DNA修复延迟现象。进一步表明PTEN可能通过PI3K-Akt信号转导通路增强对肝癌细胞系SMMC-7721细胞的辐射敏感作用。 结论: 1、PTEN对肝癌细胞具有放疗增敏作用; 2、PTEN可以使细胞发生G2/M期阻滞、提高受照细胞的凋亡率、延迟细胞的DNA双链断裂修复; 3、PTEN可能通过PI3K-Akt信号转导通路增强对肝癌细胞的辐射敏感作用; 4、以PTEN为治疗靶点,联合辐射诱导技术对原发性肝癌进行的实验尝试,可为原发性肝癌的放射治疗提供新的理论和实践视角,为肿瘤基因-放射治疗应用临床提供理论支持。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 朱明月;符史干;李孟森;谢协驹;李刚;;甲胎蛋白抑制PTEN活性导致肝癌细胞耐受ATRA诱导的凋亡[J];生物化学与生物物理进展;2011年03期
2 张鸽文;王志明;;MAGI1通过调节PETN抑制肝癌细胞的侵袭运动(英文)[J];中南大学学报(医学版);2011年05期
3 肖华;张峰;;PTEN对15-deoxy-PGJ2调节肝癌细胞生长作用的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2006年09期
4 陈国庭;PTEN基因的研究进展[J];国外医学.遗传学分册;2001年02期
5 徐敏;PTEN/MMAC_1/TEP_1抑癌基因与子宫内膜癌的相关性[J];实用肿瘤杂志;2002年06期
6 陈明,陈洪雷,陈福春,朱润庆,刘铭球;转移性肺癌中TPEN蛋白的表达及其临床意义[J];数理医药学杂志;2002年06期
7 许逸卿,王春友,陶京,俞建雄;PTEN蛋白在胰腺癌中的表达及其意义[J];中华实验外科杂志;2003年07期
8 马玉芳,刘铭球,易建华,姚俊霞,熊奎,刘涛,朱红波;肿瘤抑癌基因PTEN在宫颈鳞癌中的表达及其与分化程度的关系[J];郧阳医学院学报;2003年01期
9 黄学勤,李清泉,李儒佑;小细胞肺癌中PTEN的表达及其与凋亡的关系[J];医师进修杂志;2004年09期
10 刘志香,路涛,黄长征,李家文,涂亚庭;皮肤肿瘤中PTEN基因突变的研究[J];中华皮肤科杂志;2004年12期
11 骆文静,陈景元,张雪萍,王文亮,陈耀明,赵芳;EB1089抑制肝癌细胞增殖的研究[J];卫生研究;2004年02期
12 戴淑真,徐冰,姚勤,李超;子宫内膜癌、宫颈癌组织中PTEN基因突变的检测及意义[J];山东医药;2003年24期
13 刘斌,吴军正,雷德林,刘彦普;PTEN基因对粘液表皮样癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用[J];中国口腔颌面外科杂志;2003年01期
14 周传香;抑癌基因PTEN与头颈肿瘤研究进展[J];国外医学.口腔医学分册;2003年03期
15 项友群,徐美荣,方庆安,施公胜;c-erbB-2、PTEN在乳腺癌中的表达及其意义[J];南通医学院学报;2004年01期
16 李秋芳,杨新建,赵建军,杨瑞玲;星形细胞瘤中PTEN蛋白表达的意义及其与微血管密度的相关性研究[J];河南实用神经疾病杂志;2004年01期
17 马佳佳,陈必良,马向东,王德堂;抑癌基因PTEN在子宫内膜异位症发生发展中的作用[J];第四军医大学学报;2004年20期
18 马佳佳,陈必良;抑癌基因PTEN与子宫内膜异位症恶变的相关性[J];国外医学.妇产科学分册;2004年05期
19 江从庆,樊利芳,刘志苏,艾中立,钱群,何跃明,郑科炎,秦前波;PTEN和缺氧诱导因子-1α在大肠腺瘤一腺癌序列中的表达及意义[J];大肠肛门病外科杂志;2004年04期
20 徐锡金,霍霞,杨海伟,许险峰,朴仲贤,沈忠英;PTEN在人食管上皮永生化细胞株和食管癌细胞株中的表达[J];激光生物学报;2005年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李祺福;洪水根;;中国鲎血低分子活性物质对癌细胞增殖分化的调控[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
2 张锦堃;张娟;李军;;树突状细胞与肝癌细胞融合瘤苗的制备和特性[A];第五届全国生物医学体视学学术会议、第八届全军军事病理学学术会议、第四届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2002年
3 张之勇;韩丽辉;孙汶生;;神经营养因子受体TRKB与肝癌细胞BEL7402抵抗失巢凋亡的研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
4 金吴东;陈龙华;;mIκBα基因转染肝癌细胞HepG2的放射增敏作用[A];2007第六届全国放射肿瘤学学术年会论文集[C];2007年
5 田德安;;Smac和AIF基因在肝癌细胞中的表达及与细胞凋亡关系的试验研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
6 傅遍红;吴泽志;秦建;;整合素亚单位对肝癌细胞与层粘连蛋白趋化迁移运动的影响[A];渗流力学与工程的创新与实践——第十一届全国渗流力学学术大会论文集[C];2011年
7 王芳;杨富;张玲;徐丹;霍希松;毕海珊;孙树汉;;微小RNA17-5p通过靶基因E2F1激活热休克蛋白27促进肝癌细胞转移(英文)[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年
8 施冬云;冯颖;谢飞舟;刘珊林;;缺氧应激对正常肝细胞和肝癌细胞能量代谢通路的不同影响[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集(第一册)[C];2011年
9 毛华;袁爱力;赖卓胜;张振书;张亚力;周殿元;;VEGF诱导肝癌细胞恶性表型及p38MAPK信号通路的调控作用[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
10 赵航宇;梁健;姜晓峰;杜志安;王学范;魏云涛;姜洪磊;;斑蝥酸钠维生素B6诱导肝癌细胞HepG2凋亡的实验研究[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张勇;抑癌基因PTEN对肝癌细胞的放射增敏作用研究[D];南方医科大学;2011年
2 宋关斌;肝癌细胞力学特性及其与细胞周期的关系研究[D];重庆大学;2002年
3 吴建兵;RNA干扰抑制BMP-2基因表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和侵袭的影响及机制[D];南昌大学;2010年
4 崔恒武;电化学对体外肝癌细胞生物学行为的作用及对肝癌患者免疫功能的影响[D];第二军医大学;2002年
5 刘妍;双特异性抗肿瘤重组腺病毒对肝癌细胞及其模型动物的治疗作用研究[D];吉林大学;2011年
6 黄海燕;表达Apoptin基因重组腺病毒对肝癌细胞BEL-7402及转移模型的抑制作用[D];吉林大学;2011年
7 李劲东;MCT1、CD147在人肝癌中的表达及其反义RNA表达载体对肝癌细胞的影响[D];中南大学;2010年
8 张弘超;树突状细胞联合多烯紫杉醇对肝癌生物学行为的影响[D];中国医科大学;2008年
9 谭晓虹;P21~(WAF1/CIP1)对肝癌细胞SMMC-7721生物学行为的影响及其与POLD1基因关系初探[D];广西医科大学;2010年
10 曹献英;纳米羟基磷灰石诱导肝癌细胞死亡的作用靶点及机理研究[D];武汉理工大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 崔国振;人脑胶质瘤中PTEN和COX-2的表达及临床意义[D];吉林大学;2010年
2 董华承;PTEN和nm23-H1在大肠癌中的表达及其临床意义[D];大连医科大学;2010年
3 方冬冬;口腔鳞癌组织中PTEN、COX-2表达和MVD测定及意义[D];安徽医科大学;2011年
4 戚红;宫颈癌中PTEN、P16和P15蛋白的表达及临床意义[D];青岛大学;2002年
5 张娇;PTEN在兔晶状体上皮细胞增殖中的表达及意义[D];中国医科大学;2003年
6 沈慧;原发性肝癌中PTEN蛋白表达及其与HBV感染的关系[D];山西医科大学;2004年
7 杨宁;非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、MVD的表达及临床意义[D];河北医科大学;2010年
8 陈伟;抑癌基因PTEN、p27在肝细胞性肝癌组织中的表达及临床相关性研究[D];安徽医科大学;2003年
9 尹凤雷;PTEN基因对T淋巴细胞分化的影响[D];河北医科大学;2011年
10 杨涛;抑癌基因PTEN与肾透明细胞癌进展的关系[D];青海大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 李大庆;我科学家发现肝癌细胞演化和迁移新路径[N];科技日报;2011年
2 贾玉容;Survivin蛋白促进肝癌细胞快速增生[N];中国医药报;2004年
3 江山;小心肝癌细胞“吃”血糖[N];大众卫生报;2005年
4 胡德荣;纳米磁微粒烧死肝癌细胞[N];健康报;2005年
5 史凤芝 陈英云;砒霜可诱导肝癌细胞“自杀”[N];大众卫生报;2000年
6 朱恒顺;山大一项免疫学成果通过鉴定[N];科技日报;2002年
7 记者 张建松;肝癌细胞为何转移[N];新华每日电讯;2000年
8 张建松;肝癌细胞转移相关染色体被发现[N];中国医药报;2000年
9 李 戎 闫智勇 李文军 张天娥;中医药防治原发性肝癌机理研究进展[N];中国中医药报;2003年
10 余志平;蛋白质水平影响乳腺癌疗效[N];中国医药报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978