收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CD99调控miR-9/PRDM1诱导H/RS细胞再分化机制

黄学平  
【摘要】:研究背景 目前研究表明恶性肿瘤的发生与细胞分化紊乱或分化阻滞密切相关,而肿瘤治疗不管是放疗、化疗,还是分子靶向治疗以及生物治疗,都是采取杀灭肿瘤细胞的治疗理念,这些治疗方法在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞也有一定的杀伤作用。越来越多的研究表明,在体内外诱导分化剂的作用下,恶性肿瘤细胞的形态、生物学或生物化学方面的诸多标志均向正常细胞的方向演化分化,甚至完全转变成正常细胞或接近正常细胞,这种现象称肿瘤细胞的再分化(redifferentiation),因此诱导分化治疗将成为未来肿瘤治疗的一个新的发展方向。 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,1832年由英国的Thomas Hodgkin最早描述,其中经典型霍奇金淋巴瘤(classic Hodgkin lymphoma, cHL)约占霍奇金淋巴瘤病例的95%。该疾病的典型形态特点是少数的肿瘤性H/RS (Hodgkin/Reed-sternberg)细胞(1%)浸润在大量的炎性反应背景细胞中。170多年来,H/RS细胞的本质以及发生发展机制等问题一直困扰着医学界。 Kuppers等采用显微切割技术从组织切片上挑取单个H/RS细胞,通过单细胞PCR技术分析Ig基因重排证实绝大部分的H/RS细胞来自淋巴器官生发中心(germinal center, GC)的前凋亡B细胞,也称为“残疾的B淋巴细胞”,该细胞具有B细胞表型丢失和发育不全的早期浆细胞分化潜能等B细胞分化紊乱的特点。寻找H/RS细胞发生过程中导致分化阻滞的关键靶点,调节其“开关”,使H/RS细胞复现B细胞的特征,回到B细胞分化的正常方向,是本研究的关键。 有报道反义CD99表达质粒转染人B淋巴瘤细胞株BJAB和IM9后,形态和免疫表型与H/RS细胞极为相似,提示CD99表达下调是H/RS细胞形成关键分子事件。转录因子PRDM1,诱导B细胞向浆细胞分化的一个开关,是浆细胞分化所必需的至关重要的调控因子。目前研究认为在cHL中PRDM1是一个重要的抑癌基因,其功能性失活阻断了B细胞向成熟浆细胞的分化,可能是cHL致病重要原因。H/RS细胞具有早期浆细胞分化潜能,诱导H/RS细胞向末端B细胞方向再分化必须打开PRDM1这一浆细胞调节关卡。最近研究发现miRNA在B细胞分化和B细胞恶性肿瘤中发挥重要作用。Nie等通过荧光素酶报告实验证实在cHL细胞株L428中PRDM1是miR-9调控的直接靶标,miR-9可以负性调控PRDM1的表达。因此,miR-9可能是导致H/RS细胞分化阻滞的又一重要靶标。 本课题组前期构建了CD99基因稳定过表达的cHL细胞株L428细胞亚系,命名为“L428-CD99”,在此基础上本研究采用免疫细胞化学、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦、原位杂交、miRNA反义寡核苷酸瞬时转染、生物信息学分析等方法,在对L428-CD99细胞亚系进行系列鉴定后,观测上调CD99后L428细胞B细胞分化相关表型、细胞形态学和细胞生物学行为等改变,明确上调CD99的H/RS细胞能否复现B细胞表型、打开向浆细胞分化的开关基因PRDM1并诱导向末端B细胞方向再分化可能性及调控机制,验证miR-9在I-H/RS细胞的表达、对靶点PRDM1的调控关系及探讨诱导再分化可能性,为进一步阐述H/RS细胞的发生发展机制提供参考依据。 研究目的 本研究拟通过四部分进行: 一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达 观测CD99和PRDM1在淋巴结反应性增生(reactive lymphoid hyperplasia,RH)、cHL组织及其细胞株、B及T细胞淋巴造血系统肿瘤细胞株中的表达差异。 二、CD99调控PRDM1的表达诱导H/RS细胞再分化 探究CD99和PRDM1的调控关系,明确上调CD99基因对cHL细胞株L428细胞诊断标记、B细胞免疫表型以及浆细胞表型的影响,揭示CD99基因在cHL发生及分化所扮演的角色。 三、miR-9在H/RS细胞中的表达及对靶点PRDM1的调控 定量和定位、转染沉默验证miR-9在L428细胞的表达及对靶点PRDM1的调控。 四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究 初步实验并借助生物信息学分析CD99和miR-9的相互调控网络,探究CD99、miR-9和PRDM1的调控关系。 研究内容与方法 一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达 收集cHL和RH组织标本,通过CD99和PRDM1的免疫组化比较其在组织上的表达差异,并进一步通过Western blot和免疫细胞化学方法检测CD99和PRDM1在六株B细胞来源和三株T细胞来源淋巴瘤细胞株的表达。 二、CD99调控PRDMl的表达诱导H/RS细胞再分化 1.L428-CD99细胞亚系的鉴定 对前期构建的慢病毒质粒稳定过表达CD99基因的L428-CD99克隆株,经荧光显微镜观察载体绿色荧光蛋白表达,利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫荧光共聚焦检测CD99 mRNA和蛋白表达。 2.CD99基因过表达对cHL细胞株L428形态特征和生物学特性的影响 利用MTT实验、HE染色和鬼笔环肽染色检测CD99基因过表达对L428细胞增殖能力、形态大小以及细胞骨架蛋白的影响。 3.CD99基因上调对L428细胞分化相关蛋白的影响 经Western blot和免疫荧光共聚焦检测CD99基因过表达前后PRDM1蛋白的表达;利用免疫细胞化学和流式细胞检测cHL诊断标记(CD30和CD15)、B细胞分化相关抗原(CD10、CD19、CD20、CD45、CD79α、BCL6、PAX5和MUM1)以及浆细胞标记(CD38和CD138)。 三、miR-9在H/RS细胞中的表达及对靶点PRDM1的调控 1.检测miR-9在L428细胞的表达 利用免疫磁珠分选人正常淋巴结CD19+B淋巴细胞作对照;实时荧光定量RT-PCR和原位杂交检测CD19+B淋巴细胞和包括L428细胞株在内的8株淋巴瘤细胞株miR-9的表达。 2.瞬时干扰miR-9对L428细胞PRDM1蛋白表达和增殖能力的影响 miR-9反义寡核苷酸瞬时转染L428细胞,荧光显微镜观察分析转染效率,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效率;Western blot和免疫荧光共聚焦检测敲低miR-9后PRDM1蛋白的表达;MTT实验分析miR-9反义寡核苷酸对L428细胞增殖能力的影响。 四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究 采用实时荧光定量RT-PCR检测CD99基因过表达前后miR-9的表达;利用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测miR-9干扰前后CD99的表达;通过生物信息学分析CD99和miR-9之间的信号调控通路。 结果 一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达 1.在RH组织,CD99主要表达于淋巴滤泡外套区和滤泡间区,PRDM1在生发中心的明带呈散在弱阳性表达;62例cHL组织中,只有1例CD99在H/RS细胞表达阳性,所有病例PRDM1均呈阴性表达。 2.CD99和PRDM1蛋白在多发性浆细胞性骨髓瘤细胞株RPMI-8226中表达较高,在L428细胞和其他B细胞起源的淋巴瘤细胞株中表达较低甚至缺失。 二、CD99调控PRDM1的表达诱导H/RS细胞再分化 1.L428-CD99细胞亚系在荧光显微镜下均可见较强的绿色荧光,实时荧光定量RT-PCR、Western blot和共聚焦显微镜检测显示,与裸细胞组和空载体组比较,L428-CD99细胞亚系CD99基因和蛋白表达均增高。 2.MTT检测发现,CD99基因过表达组较空载体组增殖减慢,差异具有显著性(F=305.917,P=0.000);HE染色后计数,L428-CD99细胞亚系20+uM细胞数占总细胞数比例为(50.187±2.518)%,较对照组细胞(77.588±5.580)%比例低,差异具有显著性(Z=-2.611,P=0.008);鬼比环肽染色发现,与对照组相比,L428-CD99细胞丝足消失,皮层丝状肌动蛋白变薄。 3. Western blot和共聚焦检测结果显示,相对于裸细胞组和空载体组,CD99基因过表达组PRDMl蛋白表达明显增加;免疫细胞化学和流式细胞检测发现,CD99基因过表达后,与对照组相比,CD30、CD15和MUM1表达降低,CD10、CD19、CD79αBCL-6、PAX5和CD38表达增高,而CD20和CD138的表达没有明显改变。 三、miR-9在H/RS细胞的表达及对靶点PRDM1的调控 1.实时荧光定量RT-PCR检测发现,与分选CD19+B细胞和其他细胞株相比,miR-9在L428细胞的表达较高,差异均具有显著性(P0.05);原位杂交结果显示,miR-9的表达定位于胞浆,其在L428细胞呈弥漫强阳性表达,在DLBCL和Burkitt's淋巴瘤细胞株呈散在弱阳性表达,在T细胞来源的]KARPAS-299和Jurkat细胞表达阴性。 2.实时荧光定量RT-PCR检测发现,与对照组相比,miR-9反义寡核苷酸组miR-9的表达水平下降了50%左右,差异具有显著性(t=-5.208,P=0.035)。 3. Western blot和免疫荧光共聚焦结果显示,miR-9反义寡核苷酸组PRDM1蛋白表达相对裸细胞组和对照组显著升高。 4.MTT检测发现,裸细胞组、对照组(NCi)和miR-9反义寡核苷酸转染组(miR-9i)不同组别间细胞增殖活性差异不具有统计学意义(F=1.069,P=0.350)。 四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究 1.实时荧光定量RT-PCR结果显示,CD99转染L428细胞组相对于空载体组miR-9的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(t=282.071,P=0.000)。 2.实时荧光定量RT-PCR检测发现,miR-9i组CD99的表达水平与对照组(NCi)和裸细胞组相当,差异不具有显著性(P=0.719和P=1.000);Western blot结果显示,与对照组(NCi)和裸细胞组相比,miR-9反义寡核苷酸转染组CD99蛋白水平未发生明显改变。 3.生物信息学分析结果表明,CD99可能通过KPNB1的中间连接与SMAD3和SMAD4联系,进一步和MYC作用,调控miR-9的表达。 结论 1.CD99和PRDM1在cHL组织和细胞株呈较低或缺失表达。 2.L428-CD99细胞亚系过表达载体稳定、CD99基因和蛋白表达水平较高,细胞增殖减慢、体积变小、细胞骨架重构;CD99基因的过表达导致H/RS细胞丢失cHL诊断标记,重现B细胞表型,上调浆细胞分化关键因子PRDM1蛋白表达,出现浆细胞标记,具有前浆母细胞分化特征。 3.miR-9在L428细胞特异性高表达;miR-9可以负性调控PRDM1的表达。 4.CD99可以负向调控miR-9表达,但miR-9不能反作用于CD99; CD99很可能通过调控miR-9进而调节PRDM1的表达。 创新之处 1.提出H/RS细胞的产生和B细胞分化阻滞和分化紊乱密切相关,揭示了CD99、rniR-9和PRDM1与cHL的发生发展紧密关联; 2.初步揭示CD99基因可能通过调节miR-9介导的PRDM1表达,从而诱导H/RS细胞复现B细胞表型,并向末端B细胞方向再分化,为阐明cHL的发生机制提供帮助,为诱导分化治疗提供理论依据和精确靶标,具有原始创新性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 高英堂;杜智;王毅军;阚学锋;朱争艳;景丽;聂福华;;肝细胞癌高表达基因cDNA文库的构建及生物信息学分析[J];生物技术通讯;2006年04期
2 鞠小丽;邵世和;郝渭滨;;幽门螺杆菌外膜蛋白hopX基因克隆表达及生物信息学分析[J];中国免疫学杂志;2008年02期
3 王卓娅;刘玉焕;李荷;;克雷伯氏菌ZD112氯氰菊酯降解酶基因的克隆与生物信息学分析[J];广东药学院学报;2008年03期
4 黄志刚;郑辉;闻人庆;李洪义;;OCA1患者TYR基因突变的生物信息学分析[J];中国优生与遗传杂志;2009年04期
5 张红梅;;糖尿病新基因SLC30A8的生物信息学分析[J];中国老年学杂志;2010年16期
6 顾永清,杨磊,潘泽民,袁红琳,谢毅;ARG1基因的生物信息学和基因表达谱分析[J];农垦医学;2003年02期
7 汤立军,胡维新,石奕武,秦志强,谭达人,刘静,邬国军;多发性骨髓瘤患者13q14.3区域一个候选抑瘤基因MYETS1的克隆与序列分析(英文)[J];生命科学研究;2004年03期
8 赵嘉庆,王健,王娅娜,丁淑琴,赵巍;细粒棘球蚴中国大陆株zw-5基因的克隆和生物信息学分析[J];宁夏医学院学报;2005年02期
9 李良仁,王继德,白杨,王群英;幽门螺杆菌OMP25基因的克隆、测序及生物信息学分析[J];广东医学;2005年06期
10 王春梅,贾春实,张亮,曹蕊,吕晓岩,严笠,百束比古,中泽南堂;瘢痕疙瘩相关基因的生物信息学研究[J];整形再造外科杂志;2005年03期
11 李艳芸;邢军;徐垚;赵林胜;李燕妮;王玉川;张维铭;;宫颈癌相关基因HLA-DRB1编码区SNPs的生物信息学分析[J];生物医学工程与临床;2006年04期
12 戴橄;汪世平;余俊龙;姜孝新;曾少华;徐绍锐;李文凯;;日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析[J];中国现代医学杂志;2006年11期
13 郭丽宏;史俊南;;变形链球菌高毒力株特异DNA片段的序列测定及生物信息学分析[J];华西口腔医学杂志;2006年06期
14 彭枫;杨寒朔;邓洪新;王瑞;杨金亮;田聆;魏于全;;大鼠睾丸限制性表达新基因Rtap2a的生物信息学分析[J];华西医学;2007年01期
15 胡平;罗军;张文炳;龙北国;;幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析[J];热带医学杂志;2007年04期
16 陈莎丽;张玉英;覃珊珊;李娟兰;金小宝;江钢锋;汪琦;;弓形虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析[J];生命科学研究;2007年04期
17 黄江;胡旭初;包怀恩;黄艳;余新炳;郎书源;廖兴江;;亚洲带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆和生物信息学分析[J];中国病原生物学杂志;2008年01期
18 王玮;刘德立;胡薇;冯正;杨忠;;日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列的预测、验证与分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2008年01期
19 曾建涛;王继红;;Visfatin转录调控的生物信息学分析[J];重庆医科大学学报;2008年03期
20 黄江;胡旭初;黄艳;余新炳;包怀恩;郎书源;廖兴江;;牛带绦虫亚洲亚种苹果酸脱氢酶基因的生物信息学分析[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2008年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 余振东;唐爱发;桂耀庭;张立兵;张键荣;叶炯贤;蔡志明;;新基因TSC21的生物信息学分析及其原核载体构建表达[A];中华医学会第八次全国男科学学术会议论文集[C];2007年
2 麻巧迎;张帅;王春义;雒珺瑜;吕丽敏;崔金杰;;一个棉铃虫致死基因的克隆和生物信息学分析[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
3 王文栋;梁辉;朱晓苏;陶卉;徐丽;司马杨虎;徐世清;;家蚕生物钟基因Bmcry1与Bmcry2的克隆及生物信息学分析[A];2011年全国时间生物医学学术会议论文集[C];2011年
4 孙应飞;樊晓丹;胡驰峰;计宏凯;李岭;李衍达;;两种肝细胞特异转录因子的生物信息学分析[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
5 邵淑敏;蒋思文;;猪APC基因家族的电子克隆,表达及其生物信息学分析[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
6 苏琦;;DADS抑制人胃癌MGC803细胞增殖差异基因表达谱构建与生物信息学分析[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
7 刘娟;赵旻;魏芸;熊金虎;伍欣星;;BLACP基因生物信息学分析[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集[C];2003年
8 付强;李祥龙;李兰会;周荣艳;;不同物种MLPH基因编码区生物信息学分析[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2010年
9 冯佩英;黄怀球;谢治;孙九峰;李希清;张军民;鲁莎;席丽艳;;马尔尼菲青霉酵母相Rsr1基因的克隆及其生物信息学分析[A];中华医学会第16次全国皮肤性病学术年会摘要集[C];2010年
10 张红梅;张锦霞;Cheung CL;管轶;周伯平;;生物信息学分析禽流感病毒H3N2和H4N6的受体结合特点[A];全国第3届中西医结合传染病学术会议暨中国中西医结合学会传染病专业委员会第2届委员会议论文汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴洽庆;人TCP11a、ZNF313基因在大肠杆菌中的蛋白表达及其在小鼠和人睾丸中的免疫组织化学分析[D];四川大学;2004年
2 王瑞;人的新基因PCIA1的全长克隆和初步功能研究[D];四川大学;2006年
3 梁光萍;人脐静脉内皮细胞缺氧早期基因表达谱研究[D];第三军医大学;2007年
4 彭翔;PI3K/Akt信号通路在腹膜间皮细胞转分化中的作用及机制研究[D];中南大学;2010年
5 王育蓉;人系膜细胞中TNFα促进IP_3R1的表达及相关信号传导通路的研究[D];中国医科大学;2010年
6 曹文枫;SLP-2蛋白在恶性肿瘤组织中的表达意义及功能初步研究[D];天津医科大学;2007年
7 何津岩;人类p100蛋白对HeLa细胞周期的影响及其机制研究[D];天津医科大学;2008年
8 曲银娥;COXⅦa在中老年男子部分雄激素缺乏综合征中的作用及机理研究[D];河北医科大学;2010年
9 邱瑾;氧糖剥夺对Cdh1蛋白表达的影响及其在星形胶质细胞反应性增殖中的作用研究[D];华中科技大学;2012年
10 贺菽嘉;胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测[D];广西医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄学平;CD99调控miR-9/PRDM1诱导H/RS细胞再分化机制[D];南方医科大学;2011年
2 陈仲中;耐辐射球菌中串联重复序列以及非编码RNA的生物信息学分析[D];浙江大学;2006年
3 肖逸群;一种编码拟南芥钙调素结合蛋白基因的载体构建及其初步表达[D];华中师范大学;2007年
4 赵昌;基于锚定RT-PCR的青蒿EST克隆、测序及生物信息学分析[D];广州中医药大学;2007年
5 武海艳;氧化亚铁硫杆菌中磁小体形成相关基因的研究[D];中南大学;2008年
6 冉昆;平邑甜茶MhVPE基因的克隆及其生物信息学分析[D];山东农业大学;2009年
7 黄关青;橡胶树甲基化过滤文库的构建与生物信息学分析[D];海南大学;2010年
8 王冲;家猫血管紧张素转换酶2基因的cDNA克隆、表达、生物信息学分析及其组织分布研究[D];华中农业大学;2005年
9 刘廷辉;欧文氏杆菌铁代谢相关基因生物信息学分析[D];河北农业大学;2006年
10 吴东明;14-3-3zeta蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[D];安徽大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 贾少强 通讯员 王静思;华大基因参与重大研究项目[N];深圳商报;2011年
2 记者谢卫群;中国完成SARS病毒主要基因克隆和蛋白表达[N];人民日报海外版;2003年
3 张中桥;黄芪对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[N];中国医药报;2006年
4 张中桥;黄芪对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[N];中国中医药报;2006年
5 衣晓峰;三种妇科肿瘤 同一基因异常[N];健康报;2007年
6 稽旭东 杨丽佳;SNCG基因去甲基化是癌症转移标记[N];健康报;2006年
7 谢明霞;针刺防治偏头痛[N];健康报;2006年
8 张中桥;肺鳞癌与人乳头瘤病毒感染有关[N];中国医药报;2006年
9 慕永平;上海中医药大学发现两古方抑制肝硬化作用机制[N];中国医药报;2006年
10 记者 刘海英;英开发出肿瘤退化实时监控新方法[N];科技日报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978