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木蹄层孔菌多糖的提取工艺及免疫活性研究

陈洁  
【摘要】:木蹄层孔菌是一种多孔菌科的药用高等真菌,其子实体水煎服用于治疗食管癌、胃癌、子宫癌。有学者对木蹄层孔菌子实体的化学成分进行了初步研究,确定其含有酚、有机酸、糖、多糖和苷类等。 目前对木蹄层孔菌的研究主要是对其甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物的抗肿瘤活性进行研究。研究表明这些提取物具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节作用。在测定浓度范围内呈现出良好的剂量依赖性。 木蹄层孔菌的不同溶剂提取物具有不同的免疫调节作用,其中的多糖备受关注,主要表现为抗肿瘤和免疫调节作用。在对木蹄层孔菌多糖诸多的研究内容中,要获得高活性的多糖,首先要解决的是提取工艺。多糖的提取主要是通过水提醇沉的工艺。水提有较多的因素影响其多糖活性,由于多糖中糖苷键易断裂而形成多个糖单体,而糖单体是没有活性的,多糖提取率和活性并不呈正比关系。抗肿瘤方面研究证明,水提所得的木蹄层孔菌多糖能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,促进细胞因子干扰素γ和肿瘤坏死因子α的分泌,促进体液免疫功能,但木蹄层孔菌多糖如何发挥免疫调节作用和抗肿瘤作用尚不完全清楚,有待进一步研究。 目的: 1.采用二次水提醇沉法提取木蹄层孔菌多糖,探讨提取工艺中影响因素对多糖活性的影响,确立优化的高活性多糖的提取工艺。 2.研究木蹄层孔菌多糖(Fomes fomentarius polysaccharides, FFP,木蹄多糖)对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用。 方法: 1.二次水提醇沉法分别提取木蹄层孔菌多糖。分别应用正交试验法和析因试验法设计试验,研究获得的多糖,计算提取率。 2.多糖含量的测定:木蹄层孔菌多糖的含量测定采用苯酚-硫酸比色法。 3.用MTT比色法检测细胞代谢MTT活力。 4.皮下接种S180肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型。 5.微量溶血酶标仪分光光度法测定血清溶血素水平。 6.采用二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene, DNFB)诱导迟发型变态反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)模型测定荷瘤小鼠的细胞免疫功能。 7.采用碳粒廓清法测定荷瘤小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能。 8.MTT法检测荷瘤小鼠脾细胞的代谢活力,ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。 结果: 1.超声时间(因素A)、提取温度(因素B)、提取时间(因素C)对木蹄层孔菌活性多糖的提取影响较大,从脾细胞代谢MTT活力极差(R)可得:第一次提取影响试验指标的因素主次顺序为ABC,方差分析结果表明,A、B、C三个因素的改变对活性都有显著性影响。根据表4-4中K1、K2、K33大小可确定A2B1C2为最佳组合:即最佳工艺为超声处理时间30min,水提温度80℃,水提时间2h。第二次提取影响试验指标的因素主次顺序为提取温度A提取时间B,方差分析结果表明,因素A、B对活性均无显著性影响。根据表4-9中K1、K2大小可确定A2B1为最佳组合:即最佳工艺水提温度90℃,水提时间20min。 2.从提取率极差(R)可得:第一次提取影响试验指标的因素主次顺序为BCA,方差分析结果表明,除B因素的改变对提取率有显著性影响外,其他因素对提取率均无显著性影响。根据表4-4中K1、K2、K3大小可确定A3B3C3为最佳组合:即最佳工艺为超声处理时间45min,水提温度100℃,水提时间3h。第二次提取影响试验指标的因素主次顺序为提取温度A提取时间B,方差分析结果表明,因素A的改变对提取率有显著性影响,因素B对提取率无显著性影响。根据表4-9中K1、K2大小可确定A3B3为最佳组合:即最佳工艺水提温度100℃,水提时间60min。 3.从含量极差(R)可得:第一次提取影响试验指标的因素主次顺序为CBA,方差分析结果表明,因素A、B、C的改变对含量均无显著性影响。根据表4-4中K1、K2、K3大小可确定A1B3C3为最佳组合:即最佳工艺为超声处理时间15min,水提温度100℃,水提时间3h。第二次提取影响试验指标的因素主次顺序为提取温度A提取时间B,方差分析结果表明,因素A的改变对含量有显著性影响、因素B对含量无显著性影响。根据表4-9中K1、K2大小可确定A3B2为最佳组合:即最佳工艺水提温度100℃,水提时间40min。 4.木蹄多糖(200,100mg/kg)腹腔给药可以提高荷瘤小鼠血清溶血素水平、促进迟发性超敏反应、增强单核吞噬细胞吞噬功能,并表现出良好的抑瘤作用,与对照组比较有统计学意义。 5.木蹄多糖(100,50μg/ml)体外可以提高荷瘤小鼠脾细胞的代谢活力,并能促进脾细胞分泌TNF-α和IFN-γ;体内给药(200,100mg/kg,腹腔注射)可以提高荷瘤小鼠血清TNF-α和IFN-γ的含量,与对照组比较有统计学意义。 结论: 1.第一次提取超声时间、水提温度、水提时间对木蹄多糖活性有显著性影响,水提温度对木蹄多糖提取率有显著性影响,超声时间、水提温度、水提时间对木蹄多糖含量无显著性影响。第二次提取水提温度、水提时间对木蹄多糖活性无显著性影响,水提温度对木蹄多糖提取率、含量有显著性影响。 2.木蹄多糖可以提高荷瘤小鼠体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。 3.木蹄多糖可以促进荷瘤小鼠免疫细胞分泌TNF-α和IFN-γ。 4.木蹄多糖的抗肿瘤作用可能与增强免疫功能有关。


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