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灵芝氯仿萃取部位免疫调节及抗肿瘤作用的实验研究

丁佩娥  
【摘要】:灵芝(Ganoderma)按中文发音拼成Lingzhi,按日文发音拼成Reishi,是几种灵芝属真菌的总称,按中国药典定义,主要指相互之间性状非常接近的赤芝[Ganoderma lucidum (Leys.ex Fr.)Karst]和紫芝(Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang)。按照科学分类法,灵芝属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝属真菌。 灵芝享誉东亚,尤其在传统中医里,灵芝作为药用的历史已超过2000多年,是目前已知作为药用最为古老的菌类之一。中国传统观念认为,灵芝具有益气安神,扶正固本之功效,被视为珍贵的中药材,是中医药宝库中的珍品。 现代研究发现,灵芝具有多种功效,如:免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、护肝、降血糖、镇静镇痛、改善记忆等。在灵芝的有效成分中,多糖、三萜类和肽类被认为是主要有效成分,受到广泛的关注。灵芝水提取物主要以多糖为主,灵芝醇提取物中含有多种有效成份,其中三萜类化合物含量较高,具有多种生物活性。对灵芝醇提物或醇提活性部位的研究发现,灵芝醇提物能改善记忆障碍模型动物的学习记忆能力,抑制小鼠肿瘤细胞的生长,抑制小鼠急性搔痒相关的反应等,灵芝三萜类化合物也具有抗肿瘤作用。然而灵芝醇提氯仿萃取部位作为一个整体对免疫功能的调节作用和抗肿瘤作用尚不十分清楚,本研究初步探讨了灵芝氯仿萃取部位的免疫调节功能和抗肿瘤作用机制。 目的: 1、制备灵芝氯仿萃取部位,即先用乙醇提取,醇提物再用氯仿萃取。 2、探讨灵芝氯仿萃取部位体外对刀豆素A (ConA)诱导的小鼠脾细胞增殖反应的影响;对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脾细胞增殖反应的影响;对正常小鼠单核/巨噬细胞吞噬功能、迟发型超敏反应(DTH)、血清溶血素水平的影响。 3、探讨灵芝氯仿萃取部位体内对环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的DTH、单核巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素水平的影响。 4、探讨灵芝氯仿萃取部位体内对荷瘤小鼠单核/巨噬细胞吞噬功能、迟发型超敏反应(DTH)、血清溶血素水平的影响。 5、探讨灵芝氯仿萃取部位体外对S180细胞增殖反应的影响;对体内荷S180实体瘤小鼠的抑瘤作用。 方法: 1、称取灵芝粗粉,加95%无水乙醇,70℃水浴回流1h,收集2次提取液,真空抽滤,50℃减压浓缩后恒温干燥,得棕色浸膏。将浸膏悬浮于水中,先后以石油醚、氯仿不同极性部位依次进行萃取,回收有机试剂,减压干燥得到氯仿萃取部位。 2、取正常小鼠脾细胞,加入灵芝氯仿萃取部位,同时加入ConA或LPS刺激,在37℃下培养48h,用MTT比色法检测ConA和LPS诱导的小鼠脾细胞的(增殖)代谢活力。 3、正常小鼠50只,随机分为5组,DMSO:橄榄油(1:9)对照组、阳性药物(灵芝多糖200mg/kg)组、灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)组,小鼠分别连续灌胃溶媒或干预药物7d。于给药后第1日用1%二硝基氟苯(dinitro-fluorobenzene, DNFB)腹部致敏,末次给药后将1%DNFB涂抹于5组实验小鼠右侧耳廓,24h后处死动物,用打孔器取相同面积两侧耳片称重,比较给药组与对照组耳廓肿胀程度。 4、正常小鼠50只,随机分为5组,DMSO:橄榄油=1:9对照组、阳性药物(灵芝多糖200mg/kg)组、灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)组,给药组小鼠分别连续灌胃干预药物7d。于第7天给药后2h,先称体重,然后每只小鼠尾静脉注射生理盐水稀释成5倍的印度墨汁0.1m1/10g(体重),分别于注射2min (t1)和12min(t2)后,用预先经肝素溶液湿润过吸头的微量加样器自眶后静脉丛取血10μl,放入盛有1ml蒸馏水的离心管中,摇匀,然后取100μl放入96孔板中,用酶标仪在450nm波长处测光密度OD值。 5、正常小鼠50只,随机分为5组,DMSO:橄榄油=1:9对照组、阳性药物(灵芝多糖200mg/kg)组、灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)组,给药组小鼠分别连续灌胃干预药物7d。给药后第2天上午,各鼠腹腔注射20%(V/V)的生理盐水兔红细胞0.2ml进行免疫,同日下午继续给药,免疫后d6(免疫当天为d0),动物摘眼球取血,分离和收集血清用于血清溶血素水平测定。 6、皮下注射环磷酰胺复制免疫功能低下的动物模型。小鼠60只,随机分为6组,正常对照组、环磷酰胺模型组、灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)+环磷酰胺组,阳性药物(灵芝多糖200mg/kg)组,采用DNFB诱导迟发型变态反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)模型,观察小鼠细胞免疫功能;碳廓清法检测单核巨噬细胞的吞噬功能;兔红细胞免疫法检测体液免疫功能。 7、建立荷S180实体瘤小鼠动物模型,DMSO:橄榄油=1:9对照组;阳性对照组灵芝多糖200mg/kg;灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)组,采用DNFB诱导DTH模型,观察小鼠细胞免疫功能;碳廓清法检测单核巨噬细胞的吞噬功能;兔红细胞免疫法检测体液免疫功能。 8、无菌取S180腹水瘤小鼠乳白色腹水,加入灵芝氯仿萃取部位,在37℃下培养48h,用MTT比色法检测S180细胞代谢活力。 9、建立荷S180实体瘤小鼠动物模型,DMSO:橄榄油=1:9对照组;阳性对照组:灵芝多糖200mg/kg;灵芝氯仿萃取部位(200,100,50mg/kg)组;连续给药7d,分离瘤体,称重,并计算抑瘤率。 10、结果以均数±标准差(mean±sd)表示,统计分析采用SPSS13.0统计软件。多个样本均数比较,经方差齐性检验后进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐性时,行Fisher方差分析,采用LSD方法进行组间两两比较;方差不齐时,作Welch法方差分析,再用Dunnett T3方法进行组间两两比较。显著性水准取α=0.05,以P0.05时,组间差异判断为具有统计学意义。 结果: 1、灵芝氯仿萃取部位高、中、低浓度(100,50,25(μg/ml)均可显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖反应(代谢活力),与ConA组比较有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.026);灵芝氯仿萃取部位高、中.低浓度(100,50, 25μg/ml)均可显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应,与LPS组比较有统计学意义(P=0.000,P=0.002,P=0.028),且在一定范围内呈浓度依赖趋势。 2、灵芝氯仿萃取部位高、中、低剂量(200,100,50mg/kg)均无提高正常小鼠DTH反应所致的耳廓肿胀度和单核巨噬细胞吞噬功能;而高、中剂量(200, 100mg/kg)均可显著地升高正常小鼠血清溶血素水平(P=0.002,P=0.031)。 3、灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200, 100mg/kg)均可显著提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠DTH反应耳廓肿胀度(P=0.000,P=0.033),提高免疫抑制小鼠细胞免疫功能;灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200, 100mg/kg)可以显著提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠体内碳粒廓清能力(P=0.001,P=0.019),提高免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬功能;灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200,100mg/kg)均可显著提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠血清溶血素水平(P=0.000,P=0.001),提高免疫抑制小鼠体液免疫功能。 4、灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200, 100mg/kg)可以显著增强荷瘤小鼠体内单核/巨噬细胞吞噬能力(P=0.001,P=0.015),提高荷瘤小鼠单核巨噬细胞吞噬功能;灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200, 100mg/kg)均可显著提高荷瘤小鼠DTH反应所致的耳廓肿胀度(P=0.001,P=0.011),提高荷瘤小鼠细胞免疫功能;灵芝氯仿萃取部位高、中剂量(200, 100mg/kg)均可显著提高荷瘤小鼠血清溶血素水平(P=0.000,P=0.000),提高荷瘤小鼠体液免疫功能。 5、灵芝氯仿萃取部位(100,50μg/ml)高、中剂量显著地抑制小鼠S180细胞的代谢活力(P=0.000,P=0.000,P=0.000);灵芝氯仿萃取部位(200μg/ml)高剂量对小鼠S180实体瘤生长有显著抑制作用(P=0.001)。 结论: 1、灵芝氯仿萃取部位体外抑制小鼠T细胞和B细胞的增殖反应。 2、灵芝醇体内氯仿萃取部位对正常小鼠的细胞免疫反应和单核/巨噬细胞的吞噬功能无明显作用,而增强小鼠的体液免疫反应。 3、采用环磷酰胺成功建立免疫功能低下的小鼠实验模型。 4、灵芝氯仿萃取部位能显著增加环磷酰胺诱导的免疫功能抑制小鼠的校正碳廓清指数A,提高吞噬活性,促进血清溶血素抗体生成,增强迟发型超敏反应,提示灵芝氯仿萃取部位能促进免疫功能低下小鼠非特异性和特异性(体液免疫和细胞免疫)免疫功能。 5、灵芝氯仿萃取部位能显著地增强荷瘤小鼠单核巨噬细胞功能,提高其校正碳廓清指数A,提高吞噬活性,促进血清溶血素抗体生成,增强迟发性超敏反应。 6、灵芝氯仿萃取部位体外显著抑制S180细胞增殖;高剂量体内对荷S180实体瘤小鼠具有免疫促进作用,可以显著抑制肿瘤的生长。


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