氟西汀对实验性自身免疫性脑脊髓疗效的实验研究

【摘要】：背景 多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)是一种主要累及中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)白质并导致多部位髓鞘脱失的自身免疫性疾病,具有易复发和高致残率的特点,其病因尚不清楚,在具有遗传易感性的个体中,由可能的环境因素激发的自身免疫机制被认为是最重要。该病呈慢性病程,常导致患者出现不同程度肢体瘫痪、视力障碍、眼球震颤、共济失调及感觉障碍等不可逆性神经功能障碍,严重影响患者生存质量。本病在北欧及北美较常见,在非洲和东方人中发病率较低。随着诊疗手段的不断改进,近年来MS的发病率在我国有明显增高的趋势,而且在我国MS已成为中青年人致残的主要原因之一。 典型的MS病灶肉眼观察为中枢神经系统白质内边界清楚的、局限的灰色半透明硬化斑,光镜下病理学特征为血管周围炎性细胞浸润伴有脱髓鞘、轴突损害和星形细胞瘢痕形成。目前造成中枢神经系统髓鞘结构破坏的主要原因尚未阐明,分子模拟学说认为MS患者感染的病毒与CNS髓鞘蛋白组分或少突胶质细胞之间存在共同抗原,病毒或某些超抗原在树突细胞等抗原呈递细胞的递呈下激活体内的T细胞(主要是CD4+Th1细胞),活化的T细胞在黏附分子的帮助下通过血脑屏障(Blood-Bbrain Barrier, BBB)与神经系统的抗原呈递细胞抗原结合后引起炎症反应从而引起脱髓鞘病理改变。作为MS病理学的特点,对浸润于CNS损害部位内免疫细胞的研究提示了免疫应答异常参与中枢神经系统的炎性反应,支持MS是一种自身免疫病的论点。MS病人接受髓磷脂碱蛋白(Myelin Basic Protein, MBP)的修饰肽配体(Altered Peptide Lligand, APL)治疗后经过免疫监测外周血和脑脊液中发现了一个强烈的MBP反应性CD4+T细胞的诱导反应,这些MBP反应性T细胞显著地产生高水平的Thl细胞因子：即肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-gamma, IFN-γ),提示了外周激活的CNS自身反应性T细胞的确参与了MS的发病过程。 目前,对MS尚没有有效的长期治疗药物,现有的治疗手段主要是针对该病的免疫学成份。在我国,常用于MS的治疗药物有皮质类固醇、干扰素β、环孢素A等。近年来,对MS的治疗有了新的进展,批准用于MS治疗的免疫调节剂及免疫抑制剂有：干扰素-β(IFN-β)、Glatiramer Actate (GA)和米托蒽醌(Novantrone)等,然而这些药物疗效的局限性、毒副作用以及剂型的不方便性都促使人们寻求新的、有效的、安全的、方便的治疗手段。 氟西汀(Fluoxetine)作为一种选择性5—羟色胺再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitors SSRI),在临床上常用于治疗MS的抑郁症状。2008年荷兰Sijens等通过一项双盲、安慰剂对照的临床研究检测分析了40名复发-缓解型多发性硬化患者,经头颅磁共振检查,发现摄入氟西汀的实验组患者的大脑神经系统发生新的炎症区域远较摄入安慰剂的对照组发生新的炎症区域少,提示氟西汀可能具有髓鞘保护作用。有关氟西汀免疫调节功能的报道为研究氟西汀对MS的作用机制提供了新的思路。氟西汀能够择性地抑制中枢神经系统突触前膜释放的5-羟色胺(5-HydroxytrypTamine,5-HT)的再摄取,增加突触间隙中5-羟色胺浓度。5-HT作为一种免疫调节因子的观点已逐渐被大家所接受。在受到抗原刺激时,5-HT能够参与调节机体的固有免疫和适应性免疫；这种作用包括对T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞活性的激活或抑制效应。此外,研究发现5-HT受体还存在于树突状细胞和T淋巴细胞。因此5-HT有可能作为树突状细胞和T淋巴细胞之间的信号传递介质,调节机体的免疫功能。进一步研究发现氟西汀有可能通过抑制核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κ3)的激活,从而减少T淋巴细胞的激活和(?)NF-α、FN-γ的表达。同时,氟西汀还能通过促进cAMP效应元件的磷酸化激活,增加脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)的表达。有报道发现,注射转录了BDNF的骨髓干细胞能减轻EAE动物模型发病严重程度,增加了轴突的髓鞘化,间接提示了增加BDNF的表达有可能促进EAE模型中脊髓髓鞘的再生。 综合以上所述,氟西汀不仅能改善患者情绪,并且有可能参与神经髓鞘的保护作用。然而,得出这个结论有待于在MS动物模型上的验证,并且进一步了解氟西汀治疗MS的作用机制。 目的 我们的研究目的是通过氟西汀治疗MS的经典动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomylitis, EAE)以期揭示氟西汀对MS的神经保护作用,并探讨氟西汀治疗MS的可能机制。 方法 1、通过随机数字表将实验大鼠随机分为模型对照组、生理盐水对照组、小剂量氟西汀组(10mg/kg)和大剂量氟西汀组(20mg/kg)。以足垫皮下注射新鲜豚鼠脊髓匀浆和腹腔注射百日咳毒素,构建EAE动物模型。①模型对照组大鼠仅以抗原免疫造模,不予其他任何干预处理；②大剂量氟西汀组和小剂量氟西汀组大鼠于免疫前2周开始每天称量体重,根据体重按氟西汀10mg/kg或20mg/kg计算用量,以灭菌蒸馏水溶解后灌胃处理,持续至实验结束；③生理盐水对照组大鼠于免疫前2周开始予等量生理盐水灌胃,并持续至实验结束。 2、EAE大鼠行为学评分标准：0分：正常；1分：皮毛不光整,尾部无力；2分：尾部瘫痪；3分：尾部瘫痪+后肢无力；4分：尾部瘫痪+部分后肢瘫痪：5分：后肢完全瘫痪；6分：四肢瘫痪；7分：濒死状态或死亡。 3、在实验结束时(免疫后第25天)取大鼠脊髓组织行HE染色及Luxol fast blue (LFB)髓鞘染色,并对切片进行炎性病灶计数和髓鞘脱失评分,观察EAE大鼠脊髓病理学改变。 4、在免疫前(Day0)、免疫后16天(Day16)及免疫后25天(Day25)通过尾静脉取血并以双抗夹心酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA)检测血清中干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)含量。 结果 1、所建立的EAE大鼠模型在临床表现、HE染色、髓鞘染色等病理检查方面均符合典型EAE的临床及病理特征； 2、各组大鼠平均在免疫后第4-5天开始出现症状,首发症状表现为皮毛无光泽、松散及脱毛；多于第8天开始出现鼠尾松弛、下垂、无力及麻痹；之后迅速出现鼠尾及双后肢瘫痪,仅以双前肢撑地爬行；或四肢无力、瘫痪,伴有尿、便失禁；随着症状的加重,大鼠食欲下降乃至拒食,体重明显减轻；免疫后14-16天达到发病高峰；在免疫后17天开始各组大鼠症状逐渐减轻,神经功能缺损评分开始下降；在免疫后第18天大剂量氟西汀组(2.25±1.03)和小剂量氟西汀组(3.27±0.33)大鼠神经功能评分较模型对照组(4.66±0.55)、生理盐水对照组(4.81±0.37)有显著性差异,并持续至实验结束。在免疫后第25天,氟西汀组大鼠神经功能基本恢复正常； 3、模型对照组(25%)、生理盐水对照组(46.7%)和小剂量氟西汀组EAE大鼠(26.7%)死亡率之间比较无显著性差异,大剂量氟西汀组EAE大鼠死亡率(73.3%)较其他三组有显著性升高； 4、与模型对照组、生理盐水对照组比较,小剂量氟西汀组在炎性病灶计数(小剂量氟西汀组：3.08±0.50；模型对照组：8.84±0.72;生理盐水对照组：11.12±1.31)、髓鞘脱失评分显著减少(小剂量氟西汀组：1.28±0.09;模型对照组：3.08±0.11；生理盐水对照组：3.24±0.11),有统计学差异； 5、在发病高峰期(免疫后16天),模型对照组、生理盐水对照组和小剂量氟西汀组EAE大鼠血清IFN-γ含量明显升高,提示其与疾病的活动性有关；同时发病高峰期小剂量氟西汀组大鼠血清IFN-γ含量(21.65±3.28)显著少于模型对照组(33.53±3.29)、生理盐水对照组(36.52±4.53),三组之间比较有统计学差异；但在免疫前及免疫后25天血清IFN-γ含量与模型对照组、生理盐水对照组比较无统计学差异；免疫前、免疫后16天和免疫后25天三组大鼠血清中TNF-α和BDNF含量之间比较均无统计学差异。 结论 我们的研究首次发现氟西汀能够显著促进EAE大鼠神经功能的恢复,其机制与氟西汀的免疫调节作用有关：氟西汀有效下调发病高峰期EAE大鼠血清IFN-γ含量；抑制EAE大鼠脊髓炎性细胞浸润,减少炎性病灶的产生和减轻脊髓脱髓鞘。根据以上研究结果,我们推测氟西汀有潜在的治疗MS的可能,但仍需进一步研究以确定氟西汀治疗MS的适宜剂量,避免因CNS中过高浓度的5羟色胺诱导了神经组织的毒性反应。