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基于电化学分子信标基因传感技术的HIV-1核酸检测新方法研究

李博  
【摘要】:研究背景和目的 获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome)简称艾滋病(AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(human immue deficiency virus, HIV)感染所引起的一种严重的传染性免疫缺陷性疾病。目前我国局部地区和特定人群疫情严重,并逐渐由高危人群向一般人群扩散,防治形势非常严峻。根据血清学反应的不同,HIV可分为HIV-1和HIV-2两型,世界上绝大部分地区(包括中国)流行的均为HIV-1。由于尚无有效治疗措施,预防感染成为控制HIV-1蔓延的主要手段。而HIV-1感染的实验室诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分,因此建立敏感实用的检测方法用于监测、诊断或血液筛查,对控制艾滋病的流行显得尤为重要。 目前临床上应用最为普遍的HIV-1血液筛查方法是基于显色反应的ELISA法,它主要针对血液中的检测蛋白(如:抗原或抗体),由于显色反应的灵敏度有限,其检测HIV-1感染窗口期较长,因此ELISA方法显然不能满足现阶段对艾滋病早期筛查的需要。 病毒核酸是HIV-1感染后出现最早的检测指标,随着分子生物学技术的应用,核酸检测法已成为HIV-1感染早期检测的重要手段。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT-PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。近来使用高灵敏度的实时荧光PCR技术,能够在HIV-1感染的前2周检测到病毒核酸。但检测仪器、试剂昂贵,操作复杂,对操作人员要求高,难以在一般实验室推广,又不适用于对大量患者的快速检测,所以同样不适于广泛的临床应用。因此,既要提高检测的敏感性、特异性,缩短窗口期,又要简便、快速和降低成本已成为HIV-1核酸检测技术发展的要求和方向。 生物传感器由于集高效、灵敏、特异、小巧、经济等优点于一身,目前已成为生命科学领域的研究热点。它利用各种类型的换能器,将待测的生物信号转换为电、声、光等可检测的物理信号,从而实现对样本中靶生物分子的检测。基于核酸杂交的基因传感器是当前发展最迅速的核酸检测方法之一,用于基因传感器的检测技术包括荧光技术,石英晶体微天平,电化学发光,表面等离子共振光谱和电化学方法等。在这些方法中,电化学方法因其受环境干扰少、信号测量简单、仪器成本低等优点而引起了人们的广泛关注。 电化学基因传感器是以核酸为敏感元件或检测对象,将核酸分子特异性识别过程中产生的信号通过电化学换能器转化为电信号,从而实现对核酸的定性或定量检测。识别元件(核酸探针)和电化学换能器(工作电极)是其两大重要组成部分;其中核酸探针的性质决定传感器的识别特异性,而工作电极的电子传导能力决定其敏感性。由于在检测过程中将电化学方法的高灵敏度和核酸分子杂交的高度序列特异性结合起来,电化学基因传感器有望成为实现简便、快速、准确、价廉的基因测定手段,并且符合HIV-1核酸检测技术发展的要求和方向,能够实现HIV-1早期筛查。 近年来,国内外已报道多种HIV电化学基因传感器,其中多数是由传统微型电极(如微型石墨电极、金喷溅电极等)上固定与HIV核酸片段互补的单链线性DNA探针分子构建而来。但传统电极电传导性能有限,且线性单链DNA探针分子作为识别元件检测特异性及灵敏度不高,如要将电化学基因传感器用于成分复杂的临床血液样品检测,需提高识别元件的识别特异性及灵敏度,同时进一步优化电极的电传导性能,建立一种高特异、超敏感的电化学基因传感检测系统,为电化学传感器在临床HIV-1检测中的应用打下坚实的基础。 识别元件的结构是影响其识别特异性及灵敏度的重要因素。目前除了传统的线性结构以外,最常见的探针结构当属茎环状结构。人们最熟悉的茎环状探针是分子信标(molecular beacons, MBs),它以其高特异性、高敏感度及可免分离实时监测的优点而成为最有效的荧光探针分子。但由于光学检测系统体积庞大,价格昂贵,维护困难,需要专业化的人员操作,MBs已经被引入电化学方法的构建,被称为电化学分子信标(electrochemical MBs,E-MBs)。为了延续MBs在溶液中以高信噪比免分离实时监测的优点,我们拟构建一种类似于荧光检测中二聚体-单体开关检测模式的E-MBs,而获得此种新型E-MBs的关键是要找到一种合适的电化学活性分子,其能标记在E-MBs序列的两端,且随着E-MBs构象的改变拥有不同的电化学特性。 胭脂红酸(Carminic acid, CA)是一种蒽醌化合物,单体形式的CA由于对二苯酚和奎宁基团的存在而表现出电化学活性(ON状态),而其二聚体形式电化学活性则会消失(OFF状态),即CA分子电化学信号的有无仅取决于其存在状态。因此CA即我们能够用来研制模拟荧光MB的电化学活性分子,拟构建的新型电化学分子信标称为电化学活性-非活性开关分子信标(electrochemically active-inactive switching MB),由于其两端均标记有CA,故也可称为胭脂红酸-分子信标(CAs-MB)。 工作电极的电子传导能力决定传感器的敏感性,而电极的修饰是提高电极电子传导性能的主要途径。近年来,电极修饰主要依靠纳米材料来进行,石墨烯(graphene)是只有一个碳原子厚度的二维材料,它是目前最薄却也最坚硬的纳米材料,且电阻率极低,这使得石墨烯及其衍生物以其优异的导电性能、大比表面积和良好的吸附能力被应用于超级电容器、场效应晶体管以及化学传感器等领域。萘酚(nafion)是具有优良化学稳定性的阳离子交换剂,可增加石墨烯的溶解度,并将其稳定固定于电极表面,形成萘酚石墨烯(Nafion-graphene)复合物膜。进而使石墨烯修饰更加均匀,导电性能更好。用此复合物膜修饰丝网印刷微电极(SPCEs),构成超灵敏电化学微电极:Nafion-graphene/SPCEs作为本项目的工作电极。同时结合新型识别元件——CAs-MB,构建出新型HIV-1的电化学基因传感系统,并对其进行方法学评价,为电化学传感器在临床HIV-1核酸检测中的应用打下坚实的基础,也为其它类型传染病的快速核酸诊断提供通用平台。 围绕以上问题,本论文的工作分为两个部分: (1)HIV-1电化学活性-非活性开关分子信标的构建及验证 (2)基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1电化学分子信标基因传感体系的构建及方法学评价研究方法 1.HIV-1电化学活性-非活性开关分子信标的构建及验证 合成并纯化针对HIV-1gag基因保守区序列的CAs-MB,用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和循环伏安法(CV)验证其茎环状结构及信号开关现象,优化CAs-MB与目的序列的杂交条件,并用差分脉冲伏安法(DPV)信号强度评价CAs-MB对HIV-1目的核酸序列的识别特异性。 2.基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1电化学分子信标基因传感体系的构建及方法学评价 在成功构建并验证HIV-1gag基因保守区识别元件——CAs-MB的基础上利用二维碳纳米材料graphene导电性能强、比表面积大和吸附能力良好的优点及Nafion溶液增加graphene溶解度,并可将其稳定修饰于电极表面的特点,制成Nafion-graphene复合物膜。用此膜修饰SPCEs,构成超灵敏电化学微电极:Nafion-graphene/SPCEs作为本项目的工作电极。优化graphene的修饰浓度,在含有0.1MKC1的5mmMFe(CN)63-/4-(1:1)的溶液中进行CV和电化学阻抗谱(EIS)检测,对工作电极的电化学性能进行表征。验证CA单体在Nafion-graphene/SPCEs上的电化学响应,并结合新型识别元件——CAs-MB,构建出基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1电化学基因传感器,同时对其检测HIV-1gag基因目的序列的性能进行评价。 结果 1、CA单体与CAs-MB的FT-IR图变化证明CA已标记于MB末端,CV图证明CAs-MB电化学活性ON和OFF状态的存在。DPV结果证实其能够在电化学平台上实现对HIV-1gag基因目的序列的特异性识别,且能够区分一个碱基的差异。杂交反应进行的最佳温度为60℃,最佳时间为30min。 2、成功构建了基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1电化学基因传感体系。Graphene浓度优化后的Nafion-graphene/SPCEs在含有0.1MKC1的5mMFe(CN)63-/4(1:1)的溶液中的CV和EIS结果均显示:Nafion-graphene/SPCEs作为工作电极电传导效率显著增高,且对CA单体的DPV响应信号远大于裸SPCE。在此基础上构建出的基于Nafion-graphene/SPCEs的HIV-1电化学基因传感体系在HIV-1gag基因目的序列浓度为40nmol/L-2.56μmol/L范围内,氧化峰电流改变值与目的核酸序列浓度的对数呈线性关系,线性方程为1(10-6A)=8.302log10(Ctarget)-13.070(R2=0.982,P0.001)。检出限可达15nmol/L 结论 本研究合成了HIV-1gag基因保守区的特异性识别元件——CAs-MB,验证其电化学活性ON和OFF状态的存在,并证实其能够在电化学平台上实现对HIV-1gag基因目的序列的特异性识别,且能够区分一个碱基的差异。在此基础上,以超灵敏电化学微电极:Nafion-graphene/SPCEs为工作电极,构建出针对HIV-1的电化学基因传感系统。本系统对HIV-1gag基因目的序列的检测在40nmol/L-2.56μmol/L浓度范围内呈线性,检出限可达15nmol/L。为电化学基因传感器在临床HIV-1核酸检测中的应用打下坚实的基础,也为其它类型传染病的快速核酸诊断提供通用平台。


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