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二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌模型的功能MRI实验研究

王梅  
【摘要】:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC;以下简称肝癌)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,5年生存率低,预后较差,严重威胁人类的健康。大约80%以上的肝癌发生在肝硬化背景下,肝炎—肝纤维化—肝硬化—肝癌是比较常见的肝癌病理学发展过程,而肝硬化后肝脏结节又经过肝脏再生结节(regenerative nodule, RN)、不典型增生结节(dysplastic nodule, DN)再到小肝癌(small HCC)(小于2cm)的演变过程。二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱导的大鼠肝细胞癌在肝癌发生、发展等很多生物学行为都与人类肝细胞癌相似,是研究人类肝细胞癌形成过程较理想的动物模型。一般在给药第1至4周为肝炎期,第5至8周为肝纤维化期,第9至12周为早期肝硬化期,在第8周开始可见肝内结节形成。 肝脏的血流量是维持肝脏功能的重要因素。肝脏血流灌注的降低,可引起肝细胞代谢障碍并最终导致肝脏功能损害,所以肝脏的血流动力学参数是判断其功能状态的重要指标,肝脏血流灌注参数的检测对临床上HCC的诊断和疗效的评估也有重要价值。血管生成是HCC发生、发展和演变的必要条件之一。随着肝脏疾病的进展和肝脏组织结构的异常,在肝硬化早期肝脏的血流灌注量比肝炎期及肝纤维化期有明显减少;而再生结节主要由门静脉供血,随着肝脏结节恶性程度的升高,结节的门静脉供血逐渐减少,肝动脉供血增加,HCC则以肝动脉供血为主。HCC的血流灌注量较邻近肝组织明显增多,不典型增生结节的血流灌注量较邻近肝组织减少,部分DN的血管可同肝癌一样很丰富。 目前HCC治疗最主要的手段是病灶完整手术切除,早期诊断对治疗方案的制定及改善患者预后有重要意义。目前对早期肝硬化结节的诊断主要依靠肝穿刺活检术,但由于肝硬化结节为多发病变,容易漏诊,且对某一个结节的组织学检查并不能反映其他再生结节的病理学改变和生物学特征;此外穿刺活检为有创性检查,存在一定的风险和并发症。因此,有必要寻找一种能够无创性地评估肝硬化结节血流动力学改变的方法。随着医学影像设备硬件和软件的发展,常规增强CT和MRI能在一定程度上反映肿瘤血管生成的程度,但由于要向体内注入对比剂,不宜作为常规随访首选的检查手段。功能MRI在全身的应用越来越广泛,如动态增强MRI(dynamic contrast-enhanced MRI)、磁共振扩散加权成像(Diffusion weighted imaging, DWI)、血氧水平依赖MRI (blood oxygen level dependent MRI, BOLD MRI)、磁共振波谱成像(magnetic resonance spectroscopy,MRS)等。DWI是通过对机体进行水分子扩散测量,可无创性反映组织的功能状况;DWI对运动比较敏感,主要反映机体内水分子扩散的自由度,从微观分子水平判断组织的组成成分;含细胞密集的肿瘤由于水分子扩散受限,在DWI上呈高信号,其表观扩散系数(apparent diffusion coefficient, ADC)减低;DWI可有效抑制肝脏背景信号,有助于局灶性病灶的显示,尤其小病灶的检测。BOLDMRI是利用组织内的脱氧血红蛋白作为内源性对比剂反映组织内血氧、血流、血容量等情况的成像技术;当组织某区域脱氧血红蛋白增多,使T2*WI上信号降低。BOLD MRI通过提供组织内血氧水平的定量信息,能更敏感与准确地反映肿瘤血管生成程度,预期能观测从肝脏增生结节到早期肝癌的转变过程,有助于肝癌的早期诊断及疗效评估。BOLD MRI最初主要应用于中枢神经系统的病理生理学研究中,通过对大脑活动时不同脑区的血流动力学和代谢变化进行监测分析,进而对脑功能区进行定位。近年来,BOLD MRI逐渐应用于肿瘤、心脏、肾脏、骨骼肌、肝脏等组织器官的功能研究。BOLD MRI在肝脏主要应用于肝脏急性出血、肝脏部分切除术后、肝纤维化等。通过比较经导管动脉栓塞术前后肝脏肿瘤信号的改变评估肝脏肿瘤经导管动脉栓塞术后的氧合作用情况,有望成为一种无创性评价肝脏肿瘤介入术后疗效的技术。通过对肝纤维化的研究,BOLD MRI可反映不同阶段肝纤维化的血流动力学改变,可用来对肝纤维化进行诊断及分期。但是,关于肝硬化结节BOLD MRI的研究还比较少。 目的 采用二乙基亚硝胺诱导大鼠形成肝硬化结节,观察不同性质结节的MR影像学表现,探讨利用ADC值及BOLD MRI对评价不同性质肝硬化结节的诊断及鉴别诊断价值。 方法 将80只Wistar雄性大鼠随机分为实验组和对照组(实验组64只,对照组16只)。实验组在其饮用水中加入DEN,配成浓度为0.01%的水溶液,隔口更换,到第14周后停药;对照组饮用纯净水,其他饲养条件同实验组。从给药后第5周至20周,每周随机选取4只实验组进行MR扫描,每隔一周抽取2只对照组大鼠行MRI扫描。扫描序列包括横断面和冠状面T2WI平扫、横断面T1WI平扫,DWI及BOLD扫描。DWI选取了10个b值,分别为0s/mm2、50s/mm2、100s/mm2、150s/mm2、200s/mm2、300s/mm2、400s/mm2、600s/mm2、800s/mm2、1000s/mm2,最后拟合得到一组ADC图。BOLD扫描方法:在大鼠麻醉状态下,先吸入空气10分钟,进行扫描,然后吸入含95%02和5%CO2的混合气体10分钟,再进行MR扫描。每只大鼠MRI扫描结束后12h内处死,解剖取出新鲜肝脏,用10%甲醛溶液固定后石蜡包埋,苏木素伊红(HE)染色。在ADC图及T2*WI图像上选取病灶最大层面,取病灶实性部分画兴趣区(ROI),每个病灶测3-4次并取其平均值。比较不同性质肝硬化结节的ADC值的差异性。测量各组结节及其周围相对均匀的肝组织在吸入混合气体前后的T2*值,经过计算得到相应的R2*值及其变化值△R2*,比较各组之间的差异。对照组则在图像最大无伪影层面画3-4个ROI,取其平均值。ROI尽量避开大血管、胆管,大小尽量一致。 统计方法:采用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料以例数、均数±标准差(x±s)表示。两组资料比较,若方差齐,采用独立样本的t检验,若方差不齐,则用Welch校正t检验。多个独立组间的计量资料比较采用单因素方差分析(one way AN OVA),组间均数差别两两比较,若方差齐性,则采用LSD检验,若方差不齐用Dunnett's T3检验。对各组间的ADC值、R2*air、R2*carb分析计算敏感度、特异度,并进行ROC(receiver operating characteristic)曲线分析,计算曲线下面积及95%可信区间。计数资料以例数、率或百分比表示。P0.05为差异有统计学意义。 结果 实验过程中8只实验组大鼠在扫描前自然死亡,1只因麻醉过量死亡。在大鼠肝癌形成过程中,先出现肝纤维化、肝硬化、肝再生结节形成到不典型增生结节、HCC形成。共有78个结节纳入了研究,其中再生结节10个,不典型增生结节16个,HCC52个。 1.T1WI和T2WI表现 RN在T1WI上以等或低信号为主,其中等信号占70%(7/10),低信号占20%(2/10);在T2WI上以等信号为主(60%,6/10)。DN在T1WI上呈等信号占68.75%(11/16),低信号占25%(4/16),高信号占6.25%(1/16);在T2WI上,等信号占62.5%(10/16),低信号占18.75%(3/16),高信号占18.75%(3/16)。HCC在T1WI上,低信号占57.69%(30/52),等信号占36.54%(19/52),高信号占5.77%(3/52);在T2WI上,多表现为高信号(96.15%,50/52)。 2.DWI表现及ADC值大小 在DWI上,随着b值的增大,肝内病灶显示越清晰。RN在DWI图像上以高信号为主,其中高信号为6个,低信号1个,等信号3个;DN亦以高信号(68.75%,11/16)为主,等信号和低信号分别占18.75%(3/16)和12.5%(2/16);HCC在DWI上以高信号为主,占94.23%(49/52),等信号占1.92%(1/52),低信号占3.85%(2/52)。RN、DN、HCC的平均ADC值分别为(0.860±0.099)×10-3mm2/s、(0.853±0.141)×10-3mm2/s、(0.716±0.147)×10-3mm2/s,对照组的平均ADC值为(0.887±0.125)×10-3mm2/s。对RN、DN、HCC与对照组经完全随机化资料的方差分析检验得出RN、DN、HCC与对照组之间的平均ADC值差异有统计学意义(F=9.447,P=0.000);经过LSD两两比较,RN与DN、对照组之间差异无统计学意义(P=0.902,P=0.631),RN与HCC之间差别有统计学意义(P=0.003);DN与对照组之间差异无统计学意义(P=0.492),DN与HCC(P=0.001)、HCC与对照组(P=0.000)之间差异均有统计学差异。以ADC值≥0.765×10-3mm2/s作为鉴别RN、DN与HCC的临界值的敏感度为80.8%,特异度为73.1%,以ADC值0.782×10-3mm2/s作为鉴别DN及HCC的临界值的敏感度为75%,特异度为76.9%。 3. BOLD MRI表现 3.1对照组、RN、DN、HCC吸入混合气体前的T2*air值分别为(12.813+2.889)ms、(14.908+4.862)ms、(13.830±4.862)ms、(24.358±8.831)ms,其R2*air值分别为(81.750±18.003)/s、(72.928±20.596)/s、(80.230±25.609)/s、(47.541±20.640)/s。 RN与DN(P=0.993)、RN与对照组(P=0.766)之间的T2*air值的差别无统计学意义,DN与对照组之间的T2*air值的差别无统计学意义(P=0.975);RN的T2*air值大于HCC(P=0.000),DN的T2*值大于HCC(P=0.000),HCC组的T2*值小于对照组(P=0.000)。RN、DN、HCC及对照组的平均R2*air值之间差别有统计学意义(P=0.000)。经过两两比较,RN与DN、对照组之间的R2*air值差别无统计学意义(P=0.394,P=0.304),DN与对照组之间的R2*air值差别无统计学意义(P=0.839);RN的R2*air值大于HCC(P=0.001),DN的R2*air值大于HCC(P=0.000),HCC组的R2*air值小于对照组(P=0.000)。 3.2吸入混合气体后对照组、RN、DN、HCC的T2*carb值分别为(14.352±2.925)ms、(15.350±4.947)ms、(15.485±6.015)ms、(27.059±12.503)ms,其R2*carb值分别为(72.467±15.114)/s、(70.030±17.572)/s、(71.775±24.462)/s、(43.471±17.144)/s。 吸入混合气体后,RN、DN、HCC及对照组之间的平均T2*carb、R2*carb值差别有统计学意义(P=0.000)。经过两两比较,RN与DN、RN与对照组间平均T2*carb值差异无统计学意义(P=1.000,P=0.991),RN的T2*carb值小于HCC(P=0.000),DN与对照组之间T2*carb值差异无统计学意义(P=0.981),DN、对照组的T2*carb值均小于HCC(P=0.000,P=0.000)。RN与DN(P=0.814)、RN与对照组(P=0.742)之间的R2*carb值差别无统计学意义,DN与对照组之间的R2*carb值差别无统计学意义(P=0.915);RN、DN及对照组的R2*carb值均大于HCC(P=0.000)。以R2*air值56.99/s作为临界值鉴别RN、DN与HCC的敏感度为84.6%,特异度75%,而以R2*carb值53.09/s作为临界值鉴别RN、DN与HCC的敏感度为80.8%,特异度75%。 3.3吸入混合气体后肝脏的ΔR2*值从大到小排列依次是对照组、DN、HCC、RN,但是方差分析结果显示,各组间未见统计学意义(F=1.446,P=0.235)。 3.4癌前结节(RN和DN)及肝癌结节周围肝组织在混合气体吸入前的R2*air值分别为(79.675±10.562)/s、(66.115+14.243)/s,吸入混合气体后的R2*carb值分别为(71.037+8.747)/s、(62.106±13.773)/s。其变化值ΔR2*值分别为(8.637±7.287)/s、(4.009±5.762)/s。经比较,两组之间的R2*air、R2*carb及ΔR2值差别均有统计学意义((P=0.003,P=0.026,P=0.048)。 结论 1.DWI有利于病灶的显示,正常肝实质、RN、DN及HCC的ADC值呈逐渐降低趋势,以ADC值≥0.765x10-3mm2/s作为鉴别RN、DN与HCC的临界值的敏感度达80.8%,特异度大73.1%。利用DWI和ADC值定量分析可以为RN、DN、HCC的鉴别诊断提供重要价值。 2.吸入混合气体前及之后的RN、DN与HCC的T2*值及R2*值均有差别,癌前结节周围的肝组织在吸入混合气体前及之后的R2*值大于肝癌,利用T2*、R2*值可为RN、DN、HCC及结节周围肝组织的鉴别诊断提供有用信息。 3.吸入混合气体后,对照组、RN、DN及HCC之间在吸入混合气体前后的ΔR2*值呈降低趋势,但其差异无统计学意义,但是可根据不同肝硬化结节周围组织的R2*值预测结节恶变可能性。


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