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点阵CO_2激光对Wistar大鼠皮肤光老化影响的研究

黄茂芳  
【摘要】:研究背景 皮肤光老化(photoaging)是指由于长期的日光照射导致皮肤衰老或加速衰老的现象。人们通常把由于遗传及不可抗拒的因素(如地心引力、机体重要器官的生理功能减退等)引起的皮肤内在性衰老称为自然老化,把由于环境因素如紫外线(ultraviolet,UV)辐射、吸烟、风吹及接触有害化学物质引起的皮肤衰老称为外源性老化。由于日光中紫外线辐射是环境因素中导致皮肤老化的主要因素,所以通常所说的外源性皮肤老化即指皮肤光老化。 长期、过量的日光照射影响皮肤的多种细胞成分和组织结构,表现为表皮不均一增厚或萎缩、黑素细胞不规则增生或减少、真皮毛细血管排列紊乱、弯曲扩张、真皮内炎症细胞浸润等等。最具有特征性的变化是日光引起的真皮基质成分的变化。 真皮基质成分包括除了水以外的所有细胞间物质,其中最主要的成分是弹力纤维、胶原纤维、氨基多糖和蛋白多糖等,这些物质均由真皮成纤维细胞合成。在人类皮肤的自然衰老过程中,弹力纤维进行性降解、片段化直至消失。而日光中紫外线照射可使弹力纤维变性,出现变形,纤维增粗、扭转、分叉,日积月累可使变性的弹力纤维呈团块状堆积,其弹性和顺应性则随之丧失,皮肤出现松弛、过度伸展后出现裂纹。 与光老化有关的另一种基质成分是胶原纤维。成年人皮肤中主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原,其中Ⅰ型胶原约占皮肤胶原成分的80%,在真皮中聚集成与皮面平行的粗大纤维束,相互交织成网,具有高度机械稳定性,是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分,也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。Ⅲ型胶原是幼稚、纤细的胶原纤维,是构成网状纤维的主要成分,日光照射可影响Ⅰ型胶原的形成,Ⅲ型胶原相对增加,最终导致成熟的胶原束减少,皮肤出现松弛和皱纹。基质中的其它成分如氨基多糖和蛋白多糖也和光老化有关。 日光中的紫外线辐射并非直接破坏上述真皮细胞及基质成分。而是可以引起真皮的炎症反应,尤其是激活血管周围的巨噬细胞和肥大细胞,引起免疫细胞浸润,炎性介质以及细胞因子可导致组织溶解酶如弹性蛋白酶、胶原酶的释放,进而缓慢溶解上述基质成分。活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)在光老化形成过程中起重要作用。UV照射可通过直接、间接等多种途径使皮肤中ROS浓度异常升高,高浓度的ROS可灭活基质金属蛋白酶抑制因子,抑制前胶原蛋白合成,并对正常胶原纤维有直接破坏作用,在光老化皮肤胶原成分损伤中也起一定的作用。同时,UV辐射的作用与受体和配体的作用相似,能激活细胞表面生长因子受体和细胞因子受体,受体激活又导致了下游独特的信号传导路径中组成成分的激活,引起一系列级联反应,诱发光老化。 UV照射导致的皮肤光老化主要与免疫抑制和免疫耐受相关。无论是细胞水平还是分子水平,UV的抑制表现为复杂的、相互关联的网络系统作用。 进行皮肤光老化相关发病及防治机制的研究很难回避有创取材的问题,由于好发于暴露部位及相关的伦理学要求,需要建立一种模拟性强、操作简便、评价指标明确的光老化动物模型。一直以来,研究多以小鼠、大鼠、豚鼠为主要光老化造模动物。有人用Wistar大鼠作为实验动物,每天照射UVA+UVB,照射8周后出现典型皮肤光老化表现。在造模过程中,紫外线照射剂量是最关键、也是最难确定的因素。造模时间一般应该在一个月以上。也有人用光敏剂加速造模进程的,Tsunemichi等认为,临床上光化学疗法中应用最多的8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP),在皮肤的吸收可明显促进缩短UVA的作用波长,从而促进光老化作用,因此,使用光敏剂会加速光老化模型的造模过程。 光老化的防治策略有多种,点阵激光已愈来愈多地应用于改善皮肤光老化。 皮肤光老化治疗的核心是刺激真皮组织基质成分,如胶原纤维、弹力纤维的新生和重排。真皮受热刺激后的反应被认为是很重要的治疗机制:当激光光束直径调节到数百微米以下作用于皮肤后,在一定的能量密度下,无论是热变性还是真正孔径的形成,这种损伤均会启动机体的程序化的创伤愈合过程,启动皮肤重建修复程序,最终导致包括表皮和真皮在内的全层皮肤的重塑和重建,达到治疗目的。 从损伤修复重建的角度来研究点阵激光,可涉及到Toll样受体的变化。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于天然免疫的一类,是白细胞介素1受体/Toll样受体超家族,主要分布于免疫细胞以及同外界相通的上皮细胞表面。TLRs可触动机体先天性免疫应答,通过MyD88(myeloid differentiation factor88,MyD88)依赖和MyD88非依赖途径启动细胞内信号转导通路,诱导特异性基因表达,分泌各种细胞因子,在启动机体防御性抗病原微生物免疫反应中发挥着重要作用。这一系列的变化与组织修复过程存在交叉重叠的反应状态,越来越多的研究显示TLRs在组织再生重建,包括光老化的修复过程中起着关键作用。不同的TLRs识别不同的内源性配体,如热激蛋白及细胞外基质的分解物,是TLR2/TLR4的内源性配体。内源性配体,如大分子的降解物、蛋白水解物、破裂细胞的胞内成分以及炎症反应产物,通过刺激TLRs信号传通路的启动而加速伤口的愈合。机体损伤之后,坏死细胞至少可以通过被TLR2识别来募集中性粒细胞并启动组织修复过程。细胞外基质透明质酸在组织损伤处可发生迅速降解,透明质酸的可溶性低分子降解产物参与多种炎症及修复过程,它们在树突状细胞及内皮细胞内经TLR4识别后可激活信号传递途径。 临床上已经证实剥脱性点阵激光可以治疗光老化。但目前的研究主要集中在点阵激光治疗的临床经验总结,从微观组织结构、细胞、分子水平等方面去研究治疗机制的基础性研究不多。 目的 我们以Wistar大鼠为实验动物进行皮肤光老化模型的制备,探讨Wistar大鼠在皮肤光老化动物模型制造中的应用及意义。并在此基础上以点阵C02激光对光老化皮肤进行治疗,观察治疗前后点阵C02激光对光老化的影响,探讨点阵CO2激光治疗光老化的机制。 方法 选取48只Wistar大鼠,其中实验组A1组16只,A2组16只;对照组B组11只;空白组C组5只。实验组A1组在照射紫外光前0.5小时在裸露皮肤上外涂8-MOP溶液。A2组以UVB强度为0.12mW/cm2,UVA强度为1.05mW/cm2的UV照射10min,每天一次,连续照射8周。A1组以同样强度的辐照,UVB每天照射10min,UVA每天照射120min;对照组B组大鼠不做照射处理。每2周观察组织学、过氧化及抗氧化指标MDA、SOD,羟脯氨酸含量等,评价光老化造模效果。造模成功后将实验组A2组随机分成D组10只,E组5只。D组与对照B组做自身对照,以低能量点阵C02激光(Active FXTM治疗头,波长10600nm,光斑大小9mm×9mm,光点0.125mm,能量50mJ/cm2,频率5Hz,重复延迟时间0.5s,10%覆盖率)与高能量C02激光(能量150mJ/cm2,其余参数同)照射D组与对照B组背部,E组与空白组C组不做处理。分别于治疗后1天、1周、2周、3周、4周取材,HE染色观察皮肤组织学;硫代巴比妥酸比色法、黄嘌呤氧化酶法测过氧化及抗氧化指标(MDA、SOD);对二甲氨基苯甲醛分光光度法测羟脯氨酸含量、以及Western-Blot法测TLR2、TLR4含量的变化。所有数据使用SPSS13.0统计软件进行分析,各组计量资料以(X±S)表示;计数资料采用两独立样本t检验;数据先进行正态性检验和方差齐性检验,方差齐性时采用one-way(ANOVA)检验,组间两两比较采用最小显著差法(LSD);不齐时采用Welch校正方法,资料不符合正态分布或方差不齐者以非参数检验进行分析。多组间样本均数的比较采用重复测量的方差分析,Mauchly球型检验不满足球形假设用校正系数(Greenhouse-Geisser)来校正自由度,以P0.05视为有统计学意义。 结果 1光老化动物造模结果: 1.1实验组A1组、A2组分别在第4周、第8周出现典型慢性光老化的皮肤临床体征及组织学表现。但A1组有56%(9/16)的死亡率。 1.2在造模的早期,在UV照射下,从第2周开始,无论是A1组还是A2实验组,大鼠皮肤中MDA含量就已经升高,并且随着光老化的进程而不断增加。而对照B组皮肤中MDA的含量基本保持稳定。 1.3在造模的早期,在UV照射下,从第2周开始,无论是A1组还是A2实验组,大鼠皮肤中SOD的含量就已经降低,并且随着光老化的进程而不断下降。而对照B组皮肤中SOD的含量基本保持稳定。 1.4在造模的早期,在UV照射下,从第2周开始,无论是A1组还是A2实验组,大鼠皮肤中Hyp含量就已经开始降低,并且随着光老化的进程而不断下降。而对照B组皮肤中Hyp的含量基本保持稳定。 2不同能量点阵激光治疗光老化D组(高能量激光治疗组为D1组,低能量激光治疗组为D2组)、对照组B组(高能量激光治疗组为B1组,低能量激光治疗组为B2组),以及未作处理的E组、空白组C组结果: 2.1随着时间的推移,激光治疗组D组光老化皮肤的肉眼观及组织学改善明显,对照组B组切片显示新生的胶原纤维增加,未作处理的E组光老化没有变化。 2.2实验期间,空白组C组与不做处理的E组的MDA含量基本保持不变。随着治疗后时间的推移,激光治疗光老化组的MDA含量逐渐下降,并且以高能量激光治疗组D1组的下降为快,到第3周已基本恢复空白组C组的正常水平;而低能量激光治疗光老化组虽然有下降,但第4周仍未降至空白C组的正常水平。对照B组在处理初期升高,1周下降至正常水平。 2.3激光治疗后D组SOD含量逐渐升高,到第3、4周保持相对平稳,回升到正常水平;就能量差异而言,从第3周开始,D组的SOD含量不受能量高低因素的限制。对照B组SOD的含量在第2周达到高峰后开始下降,第4周时已经回归到治疗前正常水平,并且对照B组SOD的含量不受能量高低差异的影响。 2.4随着治疗后时间的延长,激光治疗光老化的D组与激光治疗对照B组中的Hyp含量在不断的增加,在第4周,激光治疗光老化的D组的Hyp含量已经恢复到正常水平。就能量因素而言,高能量激光与低能量激光能引起光老化D组的Hyp含量的不同变化;但正常对照B组中则没有能量因素的差别。 2.5激光治疗光老化组D组中TLR2/TLR4随着时间、能量的变化而改变。从均数上看,两者的表达在第1天达到最高峰,在第2周降至最低,后逐渐恢复。激光处理对照组B组则不受能量差异的影响。 结论 1以Wistar大鼠作为实验动物可以构建光老化皮肤模型,在组织学上、分子生物学上能模拟人体皮肤光老化的特征性改变。 2点阵CO2激光能够改善光老化大鼠皮肤外观及组织学表现。 3点CO2激光能够改善光老化大鼠皮肤过氧化及抗氧化指标(MDA/SOD)、 4点阵CO2激光能增加皮肤中羟脯氨酸含量。 5点阵CO2激光治疗光老化过程中,TLR2/TLR4可以作为评价疗效的一个指标。


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