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复方脑康胶囊治疗Alzheimer's病的药效学研究

胡文军  
【摘要】:目的:复方脑康胶囊(Compound Naokang Capsule, CNKC)是治疗Alzheimer's病的中药复方制剂。研究CNKC提取物对PC12细胞增殖活性及对NaCN加缺糖造成缺血性样损伤细胞的影响;观察CNKC水提液对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用;以D-半乳糖老化小鼠为动物模型,研究CNKC水提液对海马神经元的凋亡级联反应的影响,探讨其作用机理,为CNKC的药效学研究和临床应用提供依据。 方法:(1) CNKC提取液对PC12细胞的促进增殖和对缺血样损伤的保护作用。①以PC12细胞为试验模型,试验组加入CNKC提取液适量,用DMEM液配制使浓度分别为0.05mg/mL,0.20mg/mL,0.80mg/mL及2.40mg/mL;对照组加等量DMEM液,观察细胞形态,MTT比色法于540nm处测定吸光度,考察细胞增殖率。②往PC12细胞中每孔加入无糖Earle's液0.5m1和NaCN溶液适量(使NaCN终浓度为20mmol/L),培养15min,制作NaCN加缺糖造成缺血样损伤PC12细胞模型;药物处理组在细胞培养液(无糖Earle's溶液和DMEM培养基)中添加CNKC水提液,使药物终浓度分别为0.05mg/mL、0.20mg/mL、0.80mg/mL及2.40mg/mL,作用4hr,吸去液体,每孔加入无糖Earle's液0.5mL,作用30min;加入NaCN液适量(使NaCN终浓度为20mmol/L),继续培养15min,吸去含NaCN培养液,用D-Hank's溶液洗两次,每孔加入DMEM液0.5mL,作用24h。观察细胞形态,MTT比色法于540nm处测定吸光度(A),同时检测细胞上清液中LDH。计算CNKC水提液对NaCN加缺糖引起PC12细胞损伤的抑制率。 (2) CNKC含药血清对PC12细胞促进增殖和对缺血样损伤的保护作用。取昆明种小鼠112只,称重,随机分为14组,即对照组(8只)、尼莫地平组(8只)、1g/kg CNKC药物组(每个取血点为一组,每组8只,共96只)。对照组给予等体积的生理盐水,尼莫地平组给予16mg/kg的尼莫地平,每日两次连续6天,末次给药后1h摘眼球取血。药物组按给药方案不同分为三个组,分别为:(i)单次给药;(ii)间隔4h给药一次,共给药二次;(iii)前二次间隔4h给药一次,以后每日两次连续3天,共给药8次;各给药方案组于末次给药后0.5h、1h、2h、3h摘眼球取血,分离血清。以NaCN加缺糖造成缺血性样损伤PC12细胞为模型,考察不同给药次数、采血时间的含药血清对模型细胞的影响;在培养液中添加CNKC含药血清、尼莫地平含药血清、空白对照组血清各适量,使血清浓度分别为1%、2%、4%、8%、16%,用于培养PC12模型细胞,MTT法于540nm处测定吸光度(A),计算CNKC药液组PC12细胞的抑制率,考察不同浓度含药血清的药效。 (3) CNKC对β-淀粉样肽诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。①培养SH-SY5Y细胞,加入不同浓度的CNKC提取液,MTT法测定吸光度(A),确定最适试验药物浓度。将SH-SY5Y细胞分为对照组、25μmol/L Aβ25-35组和0.725g/L CNKC水提液+AP25-3525μmol/L组,加药24h后,于倒置显微镜下观察细胞形态。于440nm处测定处的细胞上清液中LDH值;MTT法于波长540nm处测定吸光度(A),分别计算细胞的存活率。②Real-Time PCR检测AIF、 Cyt C、Bax. Bcl-2mRNA含量。将细胞分为对照组、25μmol/LAβ25-35组和0.725g/L CNKC加25μmol/LAβ325-35组。加药后24h,收集细胞,提取细胞总RNA,进行mRNA含量检测。mRNA含量检测步骤为待检测细胞样品的收集、细胞样品Total RNA的抽提、用逆转录酶进行逆转录合成cDNA、Real-time PCR扩增和反应等。以beta actin作为对照,通过扩增曲线与阀值线的交点来计算Ct值,通过Ct值进行数据分析。相对定量的结果通过△Ct法来进行解析,目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔCt=2Ctm-Ctn。③Western Blotting检测AIF、Cyt C、 Bax、Bcl-2蛋白含量。将细胞分为对照组、25μmol/L Aβ25-35组和CNKC0.725g/L加25μmol/L Aβ25-35组。加药后培养24h,收集细胞,提取细胞总蛋白,进行蛋白含量检测。④双染法检测细胞凋亡。将细胞分为对照组、25μmol/L Aβ25-35组和CNKC0.725g/L加25μmol/L Aβ25-35组。加药后培养24h,收集细胞。用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488nm, Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测,PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。 (4) CNKC水提液对D-半乳糖老化小鼠海马神经元凋亡级联反应的影响。①将筛选合格的健康正常昆明种小鼠100只,随机分为正常对照组(E组),D-半乳糖模型组(D组),CNKC大剂量药物组(A组)、中剂量药物组(B组)、小剂量药物组(C组),每组各20只。A、B、C、D组小鼠每日皮下注射半乳糖60mg/kg, A、B、C3个药物组分别用CNKC水提取液灌胃,给药剂量分别相当于生药量0.65g/kg,0.35g/kg和0.15g/kg,E组每日给动物注射并灌注等量的生理盐水,连续3个月,制作AD模型。对上述各组小鼠进行学习训练实验、定位航行实验。②病理学观察。将小鼠断头处死,取左侧海马经过固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、染色和封片后,光镜下观察海马组织形态结构并计数200倍下海马CA2-CA3区的神经元数量。HE常规染色,光镜观察脑组织形态学的变化。③免疫组织化学染色。取各组试验小鼠的脑组织,经固定处理后,取中段进行石蜡切片,进行免疫组织化学染色。光镜下观察细胞形态并对阳性细胞计数。④取小鼠断头取脑,剥离双侧海马,称重后使用液氮速冻保存,用Real-Time PCR检测AIF、Cyt C、Bax、Bcl-2的mRNA含量。⑤Western Blotting检测AIF、CytC、Bax、Bcl-2蛋白含量。小鼠断头取脑,剥离双侧海马,称重后加入组织裂解液进行组织匀浆,离心,取上清分装,使用BCA法进行总蛋白定量。 (5)数据均以x±s表示,所有数据用SPSS13.0统计分析软件处理。CNKC水提取液对PC12细胞增殖的影响、小鼠学习训练中游泳距离成绩和到达平台时间,采用重复测量数据的方差分析;组间多重比较采用LSD法检验。不同浓度的药物血清对PC12细胞缺血性损伤的影响,采用析因设计资料的方差分析进行统计学分析;组间多重比较采用LSD法检验。其余测量数据均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),如果有显著性差异,则组间两两比较采用LSD法(方差齐性时)或Dunnett T3法(方差不齐时)。显著性水准取α=0.05(双侧),P0.05为差异有统计学意义。 结果:(1)①细胞形态结果:倒置显微镜下观察,对照组PC12细胞在接种后24h能迅速贴壁生长,大多呈梭形,少数呈三角形,48h时细胞处于对数生长期,贴壁密度约为60%,72h时细胞生长停滞,有的孔内有细胞悬浮。在PC12细胞加入不同浓度的CNKC水提液后,细胞形态无变化,无损伤表现,长势良好,48h时细胞生长旺盛,贴壁密度约为70%(药物终浓度2.40mg/mL组),72h细胞生长速度减缓。将MTT法检测结果进行重复测量数据的方差分析,结果显示,与各自对照组比较,浓度为0.05mg/mL组在作用24小时、48小时、72小时后,吸光度(A)均为无显著差异(F=20.043, P=0.476; F=28.729, P=0.957; F=15.977, P=0.597),未显示促进细胞增殖作用;浓度为0.20mg/mL、0.80mg/mL、2.40mg/mL组在作用24小时、48小时、72小时后,吸光度(A)均有显著差异(P均小于0.05),显示了促进细胞增殖作用。由此可见,CNKC水提取液能不同程度地促进PC12细胞的增殖能力,并随着药物浓度的增加,细胞增殖率也增加。②模型组细胞的突起结构消失,细胞肿胀变圆,折光度下降,部分细胞裂解成碎片。CNKC水提液预处理后能对抗NaCN加缺糖引起的细胞形态学改变,表现为细胞突起结构的消失减少,细胞碎片的形成减少。MTT测定结果显示,与细胞模型组(A为1.52±0.15)相比,正常对照组吸光度(A)为1.98±0.02(Welch F=561.380, P=0.001),存在显著差异,表明模型组细胞活力下降。与模型组相比,浓度为0.05mg/mL浓度CNKC组的吸光度(A)无统计学意义(P=0.976),浓度为0.20mg/mL (P=0.007)、0.80mg/mL (P=0.001)、2.40mg/mL (P=0.000) CNKC组的吸光度(A)均高于模型组,细胞损伤抑制率分别为13.0%、60.9%、80.4%、93.6%,表明CNKC提取液可以改善细胞活力。LDH测定结果显示,与模型组(LDH值为657.2±47.2)相比,正常对照组LDH值为270.8±16.0(Welch F=273.717, P=0.000),低于模型组。与模型组相比,浓度为0.05mg/mL CNKC组的LDH值(633.9±35.8)无显著差异(P=0.978);而浓度为0.20mg/mL、0.80mg/mL、2.40mg/mL的LDH值均有显著差异(P均小于0.05),细胞损伤抑制率分别为6.0%、28.6%、66.8%、91.8%。PC12细胞损伤后释放至培养基中的LDH增多,模型组LDH值高于对照组,CNKC组可降低细胞LDH的释放,显示出对细胞损伤的保护作用。 (2)①不同给药次数、采血时间的含药血清对PC12细胞缺血性损伤的影响。与对照组比较,模型组的吸光度(A)有显著差异(F=142.627,P=0.000)。与模型组(吸光度(A)为1.43±0.12)比较,单次给药后0.5h.1h、2h.3h的含药血清组的吸光度(A)分别为1.37±0.09、1.41±0.09、1.45±0.10、1.45±0.07(P=0.356,P=0.745,P=0.599,P=0.670),基本未呈现细胞保护作用。二次给药后,取血时间1hr (P=0.000)、2hr (P=0.000)、3hr (P=0.000)的含药血清组,测得的吸光度(A)均有显著差异,高于模型组,显示了细胞保护作用。八次给药后0.5h.1h、2h、3h含药血清组的吸光度(A)均有显著差异(P=0.000, P=0.000, P=0.000, P=0.000),高于模型组,显示了细胞保护作用。②采用析因设计资料的方差分析方法,分析不同浓度的药物血清对PC12细胞缺血性损伤的影响。结果表明,与模型组(A=1.41±0.08)相比,空白对照组的吸光度(A)有显著差异(P=0.000),说明NaCN加缺糖可诱导PC12细胞损伤。与模型组比较,2%CNKC含药血清组测得的吸光度(A)有显著差异(F=106.953, P=0.000),4%CNKC组(F=81.629,P=0.000)和尼莫地平组(P=0.000)的吸光度(A)均有统计学意义,对缺血样损伤的PC12细胞均表现出保护作用。 (3)①SH-SH5Y细胞形态结果显示,Aβ25-35作用72h后,模型组的细胞折光度下降,突触收缩,细胞变圆,聚集,轴突长度和胞体面积小于正常对照组;而CNKC水提液与Aβ25-35共同作用72h后的细胞与模型组比较,细胞形态改善,表现为细胞突触结构消失减少,折光度增强,且细胞分布均匀。MTT法测定结果显示,与对照组比较,Aβ25-35组的A值有显著差异(F=147.104,P=0.000),低于对照组。而CNKC+Aβ25-35组的A值与Aβ25-35组也有显著差异(P=0.000),高于Aβ25-35组。结果显示,Aβ25-35可降低SH-SY5Y细胞的活性,而用CNKC水提液处理培养基,则可减轻Aβ25-35对细胞造成的损伤。LDH漏出率试验结果显示,与对照组比较,模型组(Aβ25-35组)LDH漏出率有显著差异(F=181.790,P=0.000),高于对照组,说明Aβ25-35可至SH-SY5Y细胞损伤;而CNKC+Aβ25-35组与Aβ25-35组比较有显著差异(P=0.007),低于Aβ25-35组,说明CNKC水提液对SHβSY5Y细胞具有很好的保护作用。②mRNA含量检测结果。A260nm/A280nm比值在1.8~2.0之间,同时结合RNA电泳结果,28S和18S RNA二条带清晰可见,说明RNA纯度较高,没有明显降解。对照组、模型组和药物组样品的RNA浓度分别为1140ng/μl、1044ng/μl、1020ng/μl。Real-time PCR结果显示,对照组、模型组和药物组的AIF/actin mRNA相对含量分别为0.0102±0.0027.0.1023±0.0138.0.0252±0.0043;Cyt C/actin分别为0.0256±0.0065.0.0788±0.0062.0.0331±0.0013;Bax/actin分别为0.0203±0.0012、0.1707±0.0096.0.0380±0.0010;Bcl-2/actin分别为0.0409±0.0052、0.0090±0.0015、0.0252±0.0013。与对照组比较,模型组AIF.Cyt C.Bax的mRNA含量均上升(F=60.846,P=0.013;F=89.670,P=0.000;F=420.101,P=0.002),Bcl-2mRNA含量则降低(F=104.859,P=0.012);Drug+Aβ25-35组与模型组比较,AIF.Cyt C. Bax的mRNA含量均有所降低(P=0.014;P=0.000;P=0.002),而Bcl-2的mRNA则有所升高(P=0.000)。说明CNKC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤可以起到保护作用。③蛋白浓度检测结果显示,对照组、模型组和药物组蛋白浓度分别为16.170μg/μl、16.146μg/μl.16.335μg/μl.通过灰度值分析,对照组、模型组和药物组的AIF含量为0.0145±0.0003、0.0502±0.0003、0.0261±0.0010,Bax含量为0.0252±0.0003、0.0871±0.0008、0.0519±0.0011, Cyt C含量为0.0240+0.0008、0.1045±0.0006、0.0653±0.0007,Bcl-2含量为0.0910±0.0057、0.0144±0.0003、0.0697±0.0010。与对照组相比,模型组的AIF/beta actin、Bax/beta actin、Bcl-2/beta actin、Cyt C/beta actin均有显著差异(Welch F=20950.876, P=0.000; Welch F=13197.318, P=0.000; F=14872.548, P=0.000; Welch F=6704.384; P=0.000), AIF、Bax、Cyt C含量上升,而Bcl-2的含量下降;与模型组比较,Drug+Aβ25-35组的AIF/beta actin、Bax/beta actin、Bcl-2/beta actin、 Cyt C/beta actin均有显著差异(P均为0.000),AIF、Bax、Cyt C含量下降,而Bcl-2的含量上升。这说明CNKC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤可以起到保护作用。④细胞凋亡检测结果显示,对照组、模型组和药物组的细胞凋亡率分别为3.71±1.74、17.12±3.52和7.20±1.15。与对照组相比,模型组的细胞凋亡率有显著差异(F=26.038,P=0.000),细胞凋亡率上升;与模型组比较,Drug+Aβ25-35组的细胞凋亡率有显著差异(P=0.002),凋亡率上升的趋势得到抑制,细胞凋亡率下降。这说明CNKC对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤可以起到保护作用。 (4)①将小鼠学习训练成绩进行重复测量数据的方差分析,结果显示,与AD模型组比,在第一象限(NE) CNKC水提液大、中、小剂量组到达安全平台的时间和游泳距离均无显著差异(P均大于0.05),但在第二、三、四象限,到达安全平台的时间和游泳距离均少于AD模型组(P均小于0.05)。实验结果提示,CNKC水提液有促进AD小鼠学习的效应。②HE染色可见,正常对照组海马结构的病理切片显示该处神经元无明显损伤,细胞层次正常、结构清楚。神经元细胞形态完整,排列有序,细胞核体积较大,核仁清晰可见。AD模型组海马结构在光镜下可见组织结构完整,但细胞层次减少,有些神经元形态不完整,排列稀疏、无序,细胞核体积变小,深染,结构不清,神经纤维排列紊乱。CNKC水提液大、中、小剂量组海马结构的病理切片显示该处神经元有轻微损伤,细胞层次尚可、结构较清楚。神经元细胞形态完整,排列有序,细胞核体积较大,核仁清晰可见。③mRNA含量检测结果。RNA的A260nm/A280nm比值在1.8~2.0之间,同时结合RNA电泳结果,28S和18S RNA二条带清晰可见,说明RNA纯度较高,没有明显降解。正常组、AD模型组、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组样品的RNA浓度分别为1248ng/μl、1328ng/μl、1156ng/μl、1220ng/μl、1304ng/μl。Real-time PCR结果显示,正常组、AD模型组、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组的AIF/actin mRNA相对含量分别为0.0036±0.0007、0.0092±0.0008、0.0045±0.0005.0.0051±0.0004、0.0075±0.0012;Cyt C/actin分别为00030±0.0005、0.0128±0.0023、0.0059±0.0015、0.0085±0.0022、0.0102±0.0008;Bax/actin分别为0.0028±0.0003、0.0127±0.0024、0.0050±0.0009、0.0060±0.0014、0.0094±0.0014; Bcl-2/actin分别为0.0281±0.0012、0.0027±0.0002、0.0152±0.0021、0.0103±0.0014、0.0072±0.0015。与对照组比较,模型组AIF、Cyt C、Bax基因mRNA含量均上升,Bcl-2mRNA含量则降低(P值均小于0.05);药物大、中、小剂量组与模型组比较,AIF、Cyt C、Bax基因mRNA含量均有所降低,而Bcl-2基因mRNA则有所升高(均P值0.05)。这说明CNKC水提液对D-半乳糖老化小鼠凋亡级联反应有保护作用。④蛋白浓度检测结果显示,正常组、AD模型组、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组蛋白浓度分别为17.995μg/μl、18.082μg/μl、18.388μg/μl、17.901μg/μl、18.239μg/μl。通过灰度值分析,正常组、AD模型组、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组的AIF蛋白含量为0.2978±0.0195、0.7464±0.0389、0.3312±0.0297、0.6133±0.0426、0.5559±0.0393, Bax蛋白含量为01989±0.0120、0.7294±0.0512、0.2617±0.0144、0.3309±0.0235、0.4755±0.0326,Cyt C蛋白含量为0.2292±0.0133、0.8553±0.0501、0.4185±0.0300、0.4928±0.0381、0.5802±0.0394,Bcl-2蛋白含量为0.5673±0.0294、0.1994±0.0115、0.4456±0.0318、0.4304±0.0313、0.1987±0.0119。与对照组相比,模型组的AIF/beta actin、Bax/beta actin、Bcl-2/beta actin、Cyt C/beta actin均有显著差异(F=148.570, P=0.000;Welch F=173.945,P=0.000;F=213.287,P=0.000;F=200.678,P=0.000),AIF、Bax、Cyt C含量上升,而Bcl-2的含量下降;与模型组比较,药物大、中、小剂量组的AIF/beta actin、Bax/beta actin、Bcl-2/beta actin、Cyt C/beta actin均有显著差异(均P=0.000), AIF、Bax、Cyt C含量下降,而Bcl-2的含量上升。⑤Cyt C免疫组织化学染色结果显示,正常对照组的阳性细胞在海马广泛分布,细胞数量与模型组存在有显著差异。模型小鼠海马神经元阳性细胞数比正常对照小鼠增加3.7倍。Bcl-2阳性反应细胞可见,正常对照组着色浅,少有突起,细胞数目少;模型组在皮质与海马可见胞浆及突起,突起分支达三四级,胞浆内有棕黄色阳性反应颗粒,胞核不着色,阳性细胞为梭形或星形。CNKC水提液均不同程度使这二种蛋白质表达的异常有所恢复。 结论:(1) CNKC具有促进PC12细胞增殖的作用,并对NaCN加缺糖造成的缺血性样损伤细胞具有保护作用。(2) CNKC含药血清能减轻NaCN加缺糖造成的缺血性样PC12模型细胞的损伤,使存活细胞数量增加。(3) CNKC对AB25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤可以起到保护作用。(4) CNKC水提液对D-半乳糖老化小鼠凋亡级联反应有保护作用。本实验结果可为CNKC治疗AD提供一定的实验基础和理论参考。


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