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慢性粒细胞白血病中BCR-ABL调控Survivin机制的初步研究

尹虹  
【摘要】:慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML),年发病率为1/10万,是发生在造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,同时也是我国慢性白血病中最常见的一种。慢粒的临床分期可分为慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BP),发生急变后预后极差,在短期内死亡。95%的慢粒患者具有Ph染色体,并存在BCR-ABL1融合基因的表达。Ph染色体是9号和22号染色体长臂易位的结果,易位使9号染色体长臂(9q34)上的原癌基因ABL和22号染色体(22q11)上的BCR基因重新组合成BCR-ABL融合基因。在CML中,BCR-ABL融合基因转录为8.5kb的mRNA,并进一步翻译产生分子质量为210KD的BCR-ABL融合蛋白P210bcr/abl,该蛋白可作用于一系列下游的信号转导通路,包括RAS/丝裂原活化蛋白激酶通路(RAS/MAPK)、Janus激酶/信号转导与转录激活子通路(JAK/STAT)、磷脂酞肌醇3激酶/蛋白激酶B通路(PI3K/AKT)、 MYC通路等,不但调节细胞因子,影响细胞的增殖和凋亡,而且引起造血干细胞调节生长和分化的必须黏附程序的缺失,最终导致骨髓祖细胞大量增生、凋亡减少与骨髓基质细胞粘附性下降,使大量不成熟的髓细胞释放到外周血,导致慢粒的发生。 因此,BCR-ABL被认为是慢粒发病的分子基础,也是慢粒诊断、疗效观察、预后判断的有效指标。在慢粒的治疗中,伊马替尼(imatinib, IM)作为一种酪氨酸激酶抑制剂,一直是治疗慢粒的一线用药。伊马替尼在体内外均可强烈抑制ABL酪氨酸激酶的活性,特异性地抑制V-ABL的表达和细胞的增殖。伊马替尼通过占据BCR-ABL融合蛋白的ATP结合位点抑制BCR-ABL蛋白的自身磷酸化和底物磷酸化,使BCR-ABL阳性细胞的增生受抑制或者凋亡。然而,随着该药临床应用的推广,逐渐出现了对伊马替尼耐药现象。耐药的发生主要有两方面的原因:一是存在原始的白血病干细胞(LSCs)不受目前治疗药物的影响;二是BCR-ABL点突变。其中有50%以上的耐药是因为BCR-ABL突变,导致伊马替尼不能与融合蛋白ATP结合位点结合。 miRNA是基因转录后表达调控的研究热点,它参与肿瘤发生相关的信号转导过程,并影响肿瘤的发生。有研究证实miRNA-196b在急性粒细胞白血病(AML)中低表达。还发现miRNA-196b对MLL的发展起重要作用。因此认为对miRNA-196b及其靶基因的研究对于正常造血过程具有重要意义。而在本课题组之前的研究中,已经验证了miRNA-196b的靶基因为BCR-ABL, miRNA-196b过表达,则BCR-ABL表达降低或不表达;抑制miRNA-196b表达,则BCR-ABL表达升高。与miRNA相比,小干扰RNA (siRNA)也是参与RNA干扰(RNAi)的一种主要RNA,可在转录和转录后水平调节基因的表达。目前,采用化学合成法合成siRNA对目的基因进行干扰的实验技术已经非常成熟,已有部分学者对BCR-ABL融合基因的小干扰RNA进行研究。 慢粒的发生、进展都高度依赖BCR-ABL的活性,伊马替尼可以直接作用于BCR-ABL融合蛋白,miRNA-196b和siRNA可以通过作用于BCR-ABL融合基因,从RNA水平干扰调控BCR-ABL的表达,最后影响下游信号转导通路。因此,我们对其中的一些基因进行了研究。 在前期研究的基础上,我们发现生存素(Survivin)是BCR-ABL激活的信号通路中的一个下游基因,在胃癌、肺癌、老年急性白血病等疾病中,Survivin与环氧化酶(Cox-2)表达密切相关,发挥协同作用或Survivin水平依赖于Cox-2的表达。是否Cox-2也是BCR-ABL的下游基因并受到BCR-ABL的调控,我们采用miRNA、IM、siRNA三种不同的方法处理K562细胞,观察Survivin和Cox-2的表达变化,分析不同处理方法对Survivin和Cox-2表达的影响,进一步了解BCR-ABL与Cox-2之间的关系。 在BCR-ABL相关的信号转导通路中,PI3K/Akt途径的主要功能是促进细胞增殖、抑制凋亡,而PTEN基因则可抑制此途径,并在抑制过程中调节HIF-1α的表达进一步抑制HIF-1α下游的基因。在一些肿瘤的研究中已证实受HIF-1α调控的下游基因有:VEGF、Survivin、 Bcl-2、Bax等,即Survivin基因在转录水平受到HIF-1α的调控而升高。我们推测,在慢性粒细胞白血病中,Surviving PTEN、HIF-1α三个基因的表达有一定的关系。在本研究中我们对Survivi、Cox-2、HIF-1α和PTEN基因的表达进行检测,进一步分析BCR-ABL下游的信号转导通路。 本文的研究内容主要包括以下两个方面: 第一部分:三种方法抑制BCR-ABL的表达。包括miRNA-196b慢病毒稳定转染K562细胞构建K562-196b细胞株;IM处理细胞;化学合成siRNA-ABL转染K562细胞。对处理得到的细胞利用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-PE法检测细胞凋亡。 实验结果,K562-196b组细胞在荧光倒置显微镜下可清楚观察到绿色荧光蛋白,且实时荧光定量PCR结果显示miRNA-196b的表达是K562组细胞的10.32倍,证明K562-196b细胞株构建成功。实时荧光定量PCR及Western Blot的结果显示,miRNA-196b,IM和siRNA三种处理方法都可以有效的抑制BCR-ABL的表达,该结果表明三组处理组细胞均可用于后续实验。对IM处理组中miRNA-196b的表达进行检测,结果K562-IM组miRNA-196b的表达显著高于K562组(P0.05),该结果表明,miRNA-196b与BCR-ABL之间存在一调节回路。增殖和凋亡的实验结果显示miRNA-196b、IM和siRNA三种处理方法从RNA和蛋白质两个不同的水平干扰抑制BCR-ABL,都可以达到抑制K562细胞增殖、促进凋亡的作用。 第二部分:利用实时荧光定量PCR检测Survivin、Cox-2mRNA的表达,分析BCR-ABL与Cox-2之间是否有调控关系;检测]HIF-1α、 PTEN mRNA的表达,分析探讨Survivin与PTEN、HIF-1α三个基因的表达之间的关系。 结果显示,Survivin mRNA在K562-196b中表达降低,差异有统计学意义(P=0.007);在K562-IM中表达与K562组相比略有降低,但差异无统计学意义(P=0.715);在K562-siRNA-ABL中表达降低,差异有统计学意义(P=0.002)。Cox-2mRNA在三个处理组中的表达与K562组基本一致,差异无统计学意义(P0.05)。HIF-1α mRNA在K562-196b中表达降低,差异有统计学意义(P=0.007);在K562-IM中表达与K562组基本一致,且差异无统计学意义(P=0.943);在K562-siRNA-ABL中表达降低,差异有统计学意义(P=0.049)。PTEN mRNA在三个处理组中的表达均升高,且差异均有统计学意义(P0.05)。 实验结果说明,在K562细胞中成功验证了Survivin为BCR-ABL信号通路下游的基因;在K562细胞中Cox-2的表达不受到BCR-ABL的调控;且在抑制BCR-ABL表达的三个处理组中,HIF-1α表达降低而PTEN表达升高。 在慢粒中挖掘BCR-ABL融合基因与Survivin之间的相互作用关系,可以深入的了解CML的发病机制以及耐药机制,为药物的联合应用提供更多的可能和更扎实的分子基础。


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