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软骨细胞接种小孔径聚乳酸—羟基乙酸共聚物支架的方法选择

夏立恒  
【摘要】:随着我国交通运输事业的飞速发展和老龄化社会进程的逐步迈进,骨科创伤、感染、退行性变的发生率逐年增加。以关节软骨损伤为病理基础的创伤性、退变性骨性关节炎等疾患,以及因其所导致的关节疼痛和功能障碍已成为目前临床的常见病与和多发病。损伤软骨的修复问题一直是国际骨科学界、运动医学界以及生物材料学界研究的热点与难点问题。 由于软骨缺乏血管和神经的营养作用,因此,损伤后的软骨再生修复能力很低。目前临床上常用的修复方法主要为骨髓刺激和移植两类:前者如钻孔术、微骨折术;后者如骨膜移植术、自体骨软骨镶嵌成型术(Mosaicplasty)以及自体软骨细胞移植(ACI)术等。上述已成熟的修复技术虽然能够取得一定的临床疗效,但均难以获得满意的修复效果,例如,通过刺激骨髓的方法仅能产生纤维软骨来修复软骨缺损的区域;而通过移植技术修复软骨缺损,必然会导致供区损伤,在缺损面积较大的情况下,移植技术很难满足临床需要。 组织工程技术的飞速发展为软骨修复提供了全新的思路和技术方法,美国食品药物管理局(FDA)批准组织工程产品应用于临床治疗进一步肯定了组织工程产品的临床治疗效果。组织工程研究主要集中在以下方面:种子细胞,组织工程支架,工程化组织的体内、外构建。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]因具有良好的生物相容性,可调节的降解速率以及良好的力学性能等优点,已被广泛应用于组织工程领域的研究。组织工程支架的多孔性有利于细胞的增殖、迁移和物质交换,同时加速支架的降解过程。骨组织工程所需要的支架孔径较大,这样有利于物质交换和血管的长入,促进基质矿化和骨的生成;而软骨组织工程所需的支架孔径一般较小,这样可以降低局部的氧张力,增加细胞之间的联系,更利于有软骨的再生。因此,文献报道的旨在成骨的组织工程支架多为大于100u m的大孔径支架,而旨在再生软骨的组织工程支架多为小于100u m孔径的小孔径支架。其中,细胞接种至支架的孔隙内是建立组织工程三维培养的首要环节。但是,支架的孔隙内存在大量气体,气体和液体之间产生的表面张力阻碍细胞的向内迁移和物质交换,同时支架的疏水性也在一定程度上影响细胞的粘附、迁移和增殖。有研究表明,负压接种法可以在接种细胞的同时排除支架孔隙内的气体,提高细胞的接种效率,同时证实了100mm Hg的负压可以取得较好的细胞接种效果。但是此前关于负压接种法的研究多为旨在成骨的大于100μ m孔径的支架,而适合软骨组织工程研究的支架孔径较小,多小于100μ m,负压法应用于小于100μ m的小孔径支架其细胞接种的效果如何还未见有相关报道。因此,研究负压法是否同样适用于旨在成软骨的小孔径支架是很有必要的。有文献报道,细胞接种起始外围的细胞粘附影响细胞向内的迁移和生长,小孔径支架比大孔径支架更易产生外围的阻挡作用。对小孔径PLGA支架采用何种接种方法更为适合,有待进一步研究。 但是,无论组织工程领域的何种研究,其最终目的都是为了提高工程化组织的构建效果,新技术及产品的体内效果验证是必不可少环节,因此动物实验在组织工程研究中是必不可少的关键环节。动物实验在软骨组织工程中的主要作用是:方法可行性的验证、产品安全性的评价、最佳应用指标的预测等等,作为新技术方法的临床前研究,起着至关重要的纽带作用。但是,在实验设计中对动物模型的选择是困难而又费时的,因此,有必要对组织工程化软骨构建研究中动物模型的选择原则、已有动物模型各自的特点和应用做一综述。 本文主要比较200-300μ m和50-100μ m两种不同孔径的PLGA支架采用负压法进行软骨细胞接种的接种效果;以及通过对比负压法、注射法、振荡法对小孔径PLGA多孔支架进行软骨细胞接种的效果,探讨适用于小孔径PLGA支架的最佳接种方法。在本文结尾部分综述了组织工程化骨与软骨复合体构建研究中动物模型的选择原则、已有动物模型各自的特点和应用情况。 软骨细胞接种小孔径聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的方法选择 第1部分新西兰大白兔肋软骨细胞的获取、扩增与鉴定 目的 获取用于作为种子细胞的新西兰大白兔肋软骨细胞,并对其进行原代培养、传代扩大培养与细胞鉴定。 方法 1.新西兰大白兔原代肋软骨细胞的获取、培养与鉴定 无菌条件下取双侧肋软骨,剪碎,用0.25%胰蛋白酶37℃条件下消化30min,离心去上清,加0.2%Ⅱ型胶原酶消化6-8h,离心,DMEM漂洗沉淀。将获得的软骨细胞接种于培养瓶内,添加细胞培养液,置于5%CO2、37℃孵箱内培养,3d后进行第1次换液,进行细胞观察并用阿利新蓝法对软骨细胞分泌基质的能力进行染色鉴定。 2.新西兰大白兔原代肋软骨细胞的传代扩增与鉴定 原代培养细胞达到80%-90%融合后,用0.25%-0.01%胰蛋白酶-EDTA混合液消化细胞,进行传代扩大培养,培养至第2代进行Ⅱ型胶原免疫组织化学法染色,鉴定其软骨细胞表型是否仍存在以及Ⅱ型胶原的分泌能力。 结果 分离培养的新西兰大白兔原代肋软骨细胞阿利新蓝染色呈阳性,传代培养至第2代后,Ⅱ型胶原免疫组织化学法染色呈阳性表达,经鉴定符合肋软骨细胞特征。 结论 两步酶消化法能够获取实验要求的肋软骨细胞,传代培养至第2代仍保持其透明软骨细胞表型。 第2部分支架的孔径对软骨细胞负压法接种效果的影响 目的 比较200-300u m和50-100u m两种不同孔径的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]支架采用负压法进行软骨细胞接种的接种效果。 方法 运用负压法分别对上述两种孔径的PLGA支架进行第2代软骨细胞接种。200-300μ m组为A组,50-100μ m为B组(n=9)。接种48h后,Hoechst33285法检测支架内的DNA含量并通过支架的干重进行标准化(ng/mg),以检测细胞的接种效率;接种含有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)的无细胞纤维蛋白凝胶,观察凝胶分布,以证实凝胶是否会阻塞支架的孔径;硬组织切片,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色观察支架内的细胞分布;接种7d后,扫描电镜(SEM)观察支架外周和内部的软骨细胞形态;alamarblue法检测两组支架内细胞的增殖趋势,时间点为接种后Id、3d、5d、d、9d。 结果 DNA定量结果显示A组的DNA含量为498.51±40.18ng/mg,B组的DNA含量为657.32±89.68ng/mg,A组B组(t=2.799,P=0.049);A组和B组的纤维蛋白凝胶均能实现在支架内的均匀分布;DAPI染色结果显示,A组支架内软骨细胞分布较为均匀,而B组的细胞多分布在支架的外周;扫描电镜结果显示A组支架孔隙内有较多的软骨细胞黏附,而B组支架内鲜有细胞附着;增殖实验结果显示A组和B组增殖趋势一致,后期A组增殖较快,两组至第9d时细胞量差异无统计学意义(t=2.246,P=0.088)。 结论 负压法应用于200-300μ m的大孔径PLGA支架可以取得较好的接种效果,但是其不适用于对50-100μ m的小孔径PLGA支架进行软骨细胞接种。 第3部分软骨细胞接种小孔径PLGA支架的方法选择 目的 比较负压法、注射法、振荡法对50-100μ m小孔径PLGA多孔支架进行软骨细胞接种的效果,探讨其最佳接种方法。 方法 分离培养新西兰大白兔肋软骨细胞,传代培养至第2代,使用纤维蛋白原溶液混悬细胞,采用负压法、注射法、振荡法(n=9)对50~100μ m孔径(孔隙率92%)的PLGA支架进行软骨细胞接种。接种48h后,Hoechst33258法检测支架内DNA含量,用支架的干重进行标准化(ng/mg);硬组织切片、DAPI染色观察支架内细胞分布。接种含FITC的无细胞纤维蛋白原,观察凝胶分布。培养7d后,扫描电镜观察支架表面及内部的细胞形态;部分支架(n=3)植入裸鼠皮下,8周后取出做石蜡切片,进行甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学法染色,使用Image-Pro Plus6.0软件分析染色后图像的累计光密度值,评价体内成软骨效果。 结果 负压组DNA含量为(657.32±89.68)ng/mg,注射组为(755.79±80.50) ng/mg,振荡组为(650.18±106.33) ng/mg,各组间差异无统计学意义(F=1.214,P=0.361):DAPI染色显示注射组细胞分布较负压组和注射组均匀;各组的纤维蛋白凝胶都均匀分布在支架内;扫描电镜结果显示负压组和振荡组外周细胞较注射组多,而支架孔隙内仅注射组可见细胞黏附;石蜡切片结果显示注射组支架内软骨基质和Ⅱ型胶原分布较另两组广泛(P=0.000)。 结论 对于50~100μ m的小孔径PLGA多孔支架,注射法是一种相对较为快捷、高效的细胞接种方法。


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