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BMP2介导的成骨通路在颅咽管瘤钙化中的机制研究及颅咽管瘤鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立

颜小荣  
【摘要】:研究背景 颅咽管瘤是一种沿颅咽管生长的上皮源性肿瘤,是颅内最常见的先天性肿瘤之一,约占颅内肿瘤的4.7%-6.5%。在儿童中所有颅内肿瘤中其发病率约为6%-13%,在儿童鞍区肿瘤中的比例超过60%。1904年奥地利科学家Erdheim首次将颅咽管瘤与胚胎“垂体-咽导管”联系起来,并将其作为一类单独的鞍区肿瘤进行了描述。早期颅咽管瘤的命名经历过"Rathke' s囊肿瘤”,垂体管肿瘤,颅咽导管肿瘤,釉质细胞瘤等名称。1931年Frazier和Alpers首先使用了颅咽管瘤这一名称,1932年Cushing在其出版的《颅脑肿瘤》一书中,以“颅咽管瘤”为名称对其进行了较为详细的描述,统一了这个肿瘤的命名,并一直沿用至今。一百多年来国内外学者针对颅咽管瘤的起源,发生等领域进行了大量广泛而深入的研究,但受限于研究模型及研究技术等限制,对肿瘤的病理学特征,肿瘤生物学特性等方面的认识仍存在较大的争议。 颅咽管瘤属于WHO-Ⅰ级的良性肿瘤,组织学上,颅咽管瘤可分为:造釉细胞型颅咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma ACP)和鳞状乳头型颅咽管(squamous papillary craniopharyngioma SPCP)两种亚型,前者好发于儿童患者,多有钙化、炎症,囊性变等表现,后者以成人多见,实性肿瘤较多。颅咽管瘤生长方式多样,肿瘤所在的鞍区存在包括垂体柄,视神经,视交叉,下丘脑等在内的多个重要结构,手术治疗中如果要对颅咽管瘤进行全切除,则容易损伤周围重要组织,造成相应并发症,严重者甚至引起死亡。而若仅对肿瘤行部分切除,则复发率极高。因此较好的切除颅咽管瘤并尽量不损伤其周围重要结构一直是神经外科医生面临的重要难题。 在颅咽管瘤治疗的诸多危险因素当中,钙化是其中较为重要的一个。颅咽管瘤钙化率高,成人钙化率约60%,在儿童中钙化率超过85%。大量临床资料表明,颅咽管瘤的钙化灶常与垂体柄、视交叉、颈内动脉,三脑室底等结构联系紧密,手术中对其完整剥离存在较大困难。颅咽管瘤的钙化灶以羟基磷灰石结合多种纤维构成,大块状钙化灶质地多坚韧,术中难以分割切除,整体取出则容易造成对周围结构的损伤,引起严重后果。 临床病理资料显示:发生钙化的颅咽管瘤多为造釉细胞型,而鳞状乳头型则基本不发生钙化。组织学上,造釉细胞型颅咽管瘤与牙源性上皮肿瘤及组织存在较大的相似性。牙源性组织所特有的釉质蛋白在造釉细胞型颅咽管瘤中也有表达,而在鳞状乳头颅咽管瘤中则没有发现。结合“垂体管”发育过程中的分化路径,有学者认为虽然在来源上,造釉细胞型颅咽管瘤和鳞状乳头型颅咽管瘤均来自于胚胎“垂体-口咽管”的残余组织,但其起源位置并不相同,前者起源于口凹牙源性组织,而后者起源于颊粘膜组织。 我们的前期研究发现骨桥蛋白(osteopontin OPN)在造釉细胞型颅咽管瘤尤其是钙化严重的颅咽管瘤中出现高表达,而在鳞状乳头型颅咽管瘤中表达较低。骨桥蛋白是一种细胞分泌型蛋白,由于其自身结构特点,骨桥蛋白对钙盐具有较强的亲和力。因此,在骨质及牙齿形成的过程中,骨桥蛋白是细胞与矿物质,细胞与细胞,矿物质与矿物质之间结合的“桥梁”蛋白。骨质中的成骨细胞,破骨细胞等均能合成骨桥蛋白,其在骨质合成,分解等代谢过程中均扮演了重要的角色。 骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein BMP)是一种具有成骨诱导能力的生长因子,属于转化生长因子-p(transforminggrowthfactor-β TGF-β)超家族成员之一。除能诱导骨质形成之外,BMPs参与了细胞的增殖,分化及侵袭等生理过程。作为一种从骨质中提取的生长因子,BMPs能诱导新生骨的发生。目前临床上将其作为促进骨折愈合材料的应用已有十多年。BMPs促进骨质形成主要与其聚集,诱导骨髓间充质细胞分化为成骨表型有关。间充质细胞经BMP诱导之后,分化为成骨细胞进而分泌出骨质形成中所必须的各种蛋白如骨钙素(osteocalcinOCN),骨桥蛋白,胶原,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)等,进而促进了钙盐的沉积和骨质的形成。 BMP对于牙齿的形成也具有重要作用,其具有诱导牙齿造釉细胞,成牙本质细胞分化的作用。Kumamoto等通过免疫组化,发现了BMP2,4,7及其受体在牙源性造釉细胞瘤及牙胚组织中的表达,并认为这些蛋白及受体在牙源性组织及肿瘤的分化中具有重要的作用。在一些病理条件下如肿瘤钙化,血管平滑肌钙化等方面,BMP的同样作用同样突出。其能诱导平滑肌细胞,成纤维细胞分化为成骨表型,并促进钙盐在这些位置的沉积,产生异位钙化/骨化。 基于BMP在牙源性组织中的表达以及骨桥蛋白在颅咽管瘤钙化中的重要作用,我们以BMPs家族中主要因子之一BMP2作为切入点,结合BMP2所介导的通路中具有成骨分化标记作用的转录因子RUNX2及OSTERIX作为研究对象,回顾性地分析这三个成骨因子在颅咽管瘤中的表达,并结合颅咽管瘤组织学特点与这些因子在肿瘤中的表达部位及分布特点,探讨颅咽管瘤钙化的内在机制。同时,我们利用前期工作中建立的颅咽管瘤原代细胞模型,以人重组的BMP2蛋白刺激肿瘤细胞,检测BMP2通路中的重要因子RUNX2, OPN, ALP的表达,初步确定BMP2介导的成骨通路在颅咽管瘤中的调控作用,并以茜素红染色实验检测BMP2是否能直接刺激颅咽管瘤直接发生钙化。最后,我们利用低免疫生物体鸡胚作为载体,探讨建立颅咽管瘤鸡胚移植瘤实验模型的可行性,为下一步实验提供更多可选择的平台。 第一章第一节BMP2, RUXN2及OSTERIX在颅咽管瘤中的表达 目的 检测BMP2, RUNX2及OSTERIX在颅咽管瘤中的表达,发现其与颅咽管瘤钙化的关系。 方法 收集颅咽管瘤术后标本,运用免疫组化及Western-blot方法回顾性的分析颅咽管瘤病理分型及钙化分级与BMP2, RUNX2及OSTERIX之间的相关关系以及这些蛋白间的相互关系;利用HE染色观察颅咽管瘤钙化灶及其他组织学结构的特点,结合三个成骨因子在颅咽管瘤中的表达位置及分布特点,分析成骨因子的表达模式与颅咽管瘤钙化灶形成之间的关系。 结果 HE染色显示:在造釉细胞型颅咽管瘤中,常可在同一标本中观察到钙化相关上皮结构涡旋状细胞,“湿性”角化与钙化灶同时存在同一视野之中,钙化灶“生长”于其所在的“湿性”角化结构。部分颅咽管瘤钙化标本中可见含骨陷窝的类骨样组织。鳞状乳头型颅咽管瘤中均未发现钙化灶。 免疫组化结果显示:造釉细胞型颅咽管瘤中BMP2, RUNX2及OSTERIX分别在70.1%(54/77),55.8%(43/77)和50.6%(39/77)的标本中表现出中等强度以上的表达(moderate and strongly positive expression:10%阳性细胞)。鳞状乳头型颅咽管瘤中未观察到BMP2, RUNX2及OSTERIX出现中等强度以上的表达。BMP2为浆和/或膜表达,RUNX2和OSTERIX表现为核/浆表达。三个成骨因子在涡旋状细胞中表达均较强,而在外围栅栏状细胞中表达较弱。其中,RUNX2及OSTERIX常表达于涡旋状细胞及“湿性”角化和钙化灶区域周边细胞。在鳞状乳头型颅咽管瘤中未发现成骨相关因子的表达。BMP2, RUNX2在造釉细胞型颅咽管瘤中的表达高于鳞状乳头型颅咽管瘤(P值均OSTERIX0.001)。造釉细胞型颅咽管瘤中及BMP2, RUNX2在不同钙化级别分OSTERIX组中的表达差异具有统计学意义(P值均0.001),并且它们的表达与钙化级别呈正相关(P值均0.001)。及BMP2, RUNX2在发生钙化的造釉细胞型OSTERIX颅咽管瘤中的表达要高于鳞状乳头型颅咽管瘤(P值均0.001),而在未发生钙化的造釉细胞型颅咽管瘤中的表达与在鳞状乳头型颅咽管瘤中的表达差异无统计学意义(BMP2, RUNX2及OSTERIX的P值分别=0.392,0.517,0.212)。BMP2, RUNX2及OSTERIX之间的相关性分析显示造釉细胞型颅咽管瘤中其两两之间均呈正相关关系(P值均0.001)。 Western-blot结果显示:造釉细胞型颅咽管瘤中BMP2, RUNX2及OSTERIX的表达随着钙化级别的升高而升高,未钙化的造釉细胞型颅咽管瘤和鳞状乳头型颅咽管瘤中这三种蛋白的表达差异无统计学意义(BMP2,RUNX2及OSTERIX的P值分别=0.551,0.609,0.295) 结论 BMP2及其所介导的通路中重要的成骨标记性转录因子RUNX2和OSTERIX在颅咽管瘤钙化中扮演了重要的角色,BMP2可能是通过诱导颅咽管瘤发生成骨分化,最终引起肿瘤中发生钙盐沉积。 第一章第二节人重组BMP2诱导颅咽管瘤细胞发生成骨样分化研究 目的 探讨外源性人重组BMP2能否诱导颅咽管瘤细胞发生成骨分化并产生钙化。 方法 以外源性人重组BMP2刺激颅咽管瘤细胞,观察其下游功能蛋白OPN基因的表达变化。确认BMP2对OPN基因的刺激作用之后,进一步以Western-blot检测在BMP2刺激之后其成骨通路中的重要因子ALP, OPN及RUNX2的表达情况以及当BMP2的刺激作用受到其拮抗剂NOGGIN拮抗时这些因子的表达变化。最后以茜素红染液对经BMP2诱导之后的颅咽管瘤细胞进行染色,观察与对照组相比其是否会发生明显的钙盐沉积。 结果 Q-PCR结果显示:与空白对照组相比,在50ng/ml浓度下,OPN的含量开始出现略微升高,并在200ng/ml浓度BMP2刺激下出现了显著升高,四个病人样本实验组与自身对照组相比其升高倍数分别为7.6倍、4.9倍、8.7倍和5倍。 Western-blot结果显示:OPN及RUNX2在200ng/ml浓度BMP2刺激之后蛋白表达比空白对照组(BMP2组VS. CON组)高(P值均0.001.)而ALP在这两组间的表达差异无统计学意义(P=0.093),三个蛋白BMP2组的表达量均比BMP2+NOGGIN组低,差异具有统计学意义(ALP, OPN, RUNX2的P值分别为0.001,=0.029,0.001)。 茜素红染色实验:经过14天的诱导,BMP2组出现了明显的钙化灶及钙盐沉积,对照组无明显变化。BMP2+NOGGIN组的钙化比BMP2组低。 结论 颅咽管瘤细胞可被外源性人重组BMP2诱导而发生成骨分化,成为一种类成骨样细胞并产生钙盐沉积;在BMP2刺激下,其下游成骨因子会发生相应升高,并且这种作用会被NOGGIN所拮抗,显示BMP2所介导的成骨通路是颅咽管瘤钙化所依赖的重要途径。 第二章颅咽管瘤鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型的建立 目的 初步建立颅咽管瘤鸡胚绒毛尿囊膜(Chorioallantoic Membrane CAM)移植瘤模型,并评估移植瘤血管生成能力及细胞增殖能力。 方法 利用术中所得颅咽管瘤组织,异种移植到鸡胚CAM表面,建立移植瘤模型。对移植瘤瘤体周围CAM血管进行测定,评估移植瘤CAM血管生成能力,同时利用免疫组化法以CD34标记移植瘤微血管密度(Microvessel Density MVD),以PCNA检测移植瘤细胞增殖活性。 结果 成功建立颅咽管瘤CAM移植瘤模型,造釉细胞型颅咽管瘤成瘤率为47.14%,鳞状乳头型颅咽管瘤成瘤率为43.33%,两者无显著差异(P=0.726);造釉细胞型移植瘤瘤周CAM血管生成能力,微血管密度及细胞增殖活性均高于鳞状上皮型移植瘤。移植瘤的PCNA与MVD及CAM血管评分均呈正相关关系(相关系数及相应P值分别为rs=0.649,P0.001;rs=0.490,P=0.001)。 结论 采用异位异种移植的方法可在鸡胚CAM上建立颅咽管瘤移植瘤模型。移植瘤可不同程度地刺激CAM上血管生成,移植瘤自身可建立微循环,具有一定的增殖能力。


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