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激光—微弧氧化处理对纯钛表面生物活性影响的研究

郭泽鸿  
【摘要】:研究背景 种植体“骨结合(Osseointegration)"理论于20世纪60年代由Branemark教授提出,且于1965年首次使用钛种植体植入人类颌骨并完成牙缺失修复至今,纯钛种植体表面处理工艺的发展越趋成熟,促使纯钛材料广泛应用于口腔医学领域。随着口腔种植技术发展逐渐成熟,人们对生活质量要求的逐渐提高,人工种植牙作为牙列缺失缺损的首选修复方案受到广大患者的青睐,使得种植体在口腔医学中的应用日趋广泛。 纯钛具有良好的生物形容性,暴露在空气中,在高温下表面被空气氧化形成一层钝化膜。然而,仅仅良好的生物形容性,并不能更好的促进骨组织生长,无法缩短骨整合的时间。尽管目前众多的表面处理都显得十分完美,但是在口腔种植修复治疗中,短种植体的应用扩大了种植修复的适应范围,如何使得短种植体变得更可靠更稳固,这些均需要建立在良好的表面处理上,所以更快的促使骨结合,使骨结合更加稳固仍然是种植体表面处理的一直追求的目标。良好的种植体表面特征对骨结合的发生和形成起着至关重要的作用。为了缩短种植体骨结合时间,增强骨结合,纯钛种植体表面通常需做各种表面处理。通过各种表面处理改变纯钛的表面性质,使种植体表面获得良好的有利于骨结合的表面活性。 经过表面处理后,种植体的表面具有更好的生物活性。生物活性是指生物材料与活体骨产生化学键合的能力,是衡量生物材料的一个重要指标。种植体与骨组织形成结合是有新骨的形成,新骨的形成的方式有以下两种:第一,距离成骨(Distance osteogenesis),距离成骨的过程是种植体植入后,种植体的表面与骨组织创面仍有距离,这个距离就是新骨形成的空隙,新骨的生长是从骨创面向种植体的表面的方向生长,直到新骨填满空隙时新骨才与种植体接触。这个过程中,新骨并没有在种植体表面直接生长,新骨形成骨结合的过程是单向的。第二,接触成骨(Contact osteogenesis),具有生物活性的粗化的种植体表面植入后,种植体的表面与骨组织创面仍然有距离,这个空隙中充满了血液和一些种植窝备洞时所形成的骨屑,它们中含有大量的成骨细胞和成骨细胞生长所需要的养分。成骨细胞通过与种植体表面接触,在种植体表面锚定并迅速生长、分裂、增殖形成新生的骨组织,另一方骨组织创面自身修复生长也往种植体表面生长,这个过程的特点是新骨在种植体表面直接生长,形成双向生长的骨结合过程。 近年来,激光处理被用于口腔种植体表面处理领域,激光处理是一种新的处理方法,不同强度和不同类型的激光对钛表面都有不同的影响。激光蚀刻处理能在钛片上形成可控制的微孔、沟槽等结构,深度与宽度可通过调节激光能量激光照射的时间来控制,这种可以控制的、可重复性高度、精确的处理几乎可以满足所需要的理想的表面3D形貌,而且还可以减少种植体表面的污染。此外,这些微孔、沟槽结构可以显著提高种植体的扭出力,使种植体更加稳定坚固。微弧氧化(Micro-arc Oxidation, MAO)是阳极氧化技术的一种,20世纪30年代初期,由Gunterschulze和Betz首次报道,近年来也被用于口腔种植体的表面处理。钛金属经微弧氧化处理后表面可形成纳米级和微米级的多微孔结果,这种表面结构具有一定生物学活性,有利于成骨细胞的接触、铺展、增殖,能刺激加快新骨的形成,电压电流可以调节微孔孔径,但是微孔孔径不能无限增大,当电压过高时,氧化膜会爆裂。 微弧氧化处理和激光蚀刻处理的种植体都具有良好的生物相容性,采用激光作预处理再与其它处理方法结合也被证实是可行的,但是关于激光蚀刻处理和微弧氧化处理相结合的处理却未见报道。因此,本研究将探讨激光蚀刻和微弧氧化相结合的处理对纯钛表面的生物活性的影响。 目的 1.将纯钛制作成小钛片,比较几种处理方法处理的纯钛片的表面理化性质,评价激光-微弧氧化处理方法作为种植体表面处理方法的可行性。 2.比较几种处理方法处理的纯钛片的表面对人成骨肉瘤细胞系MG-63的粘附、增殖、分化的影响,为激光-微弧氧化表面处理技术能否作为种植体表面处提供理论依据。 3.设计制作钛帽,通过动物实验对比微弧氧化膜和机械光滑面的钛帽内的新骨骨量增加情况,检验微弧氧化膜的骨引导性能。 4.设计制作钛纯钛螺纹种植体,通过动物实验对比骨组织对激光-微弧氧化处理的和机械光滑面的种植体的反应,检验激光-微弧氧化处理的种植体在活体内的骨结合情况。 材料与方法 1.将纯钛片材料通过数控机床切割,加工成为直径为15mm、厚度为1.2mm的纯钛圆片样品,用200~800碳化硅砂纸逐级打磨,随后分别在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声荡洗各10分钟,室温下干燥后分组并分别做激光、微弧氧化、激光-微弧氧化处理。通过扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy, SEM)观察各组钛片表面微形貌,X射线能谱仪(Energy Dispersive X-ray spectroscopy, EDS)检测钛片表面相对元素含量,X射线衍射仪(X-ray Diffraction, XRD)检测钛片表面晶相结构。Veeco粗糙度检测仪检测各组表面的Ra值。 2.将钛片分为光滑组(A组)、激光组(B组)、微弧氧化组(C组)、激光-微弧氧化组(D组)四个组,细胞形态学观察及粘附率计算:将人成骨肉瘤细胞MG-63以1×104/cm2的浓度分别接种于四组钛片处理表面,每孔加入10%FBS和1%双抗的低糖DMEM培养液1.0ml,在37℃饱和湿度下,5%CO2的恒温孵箱中密闭培养,48小时换液。接种后将1h、3h、6h及24h的钛片取出并进行处理,使用SEM观察细胞在各个时间段在钛片表面的形态变化情况及其与钛片的粘附关系;另将接种后1h、3h、6h及24h的钛片取出进行细胞肌动蛋白直接免疫荧光染色后,使用激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)观察细胞肌动蛋白的变化。 细胞增殖活性及分化水平的研究:将人成骨肉瘤细胞MG-63接种于A、B、 C、D四组钛片表面,接种浓度及方法同前,接种后1d、3d及5d的细胞采用MTS法测其OD值,比较四组钛片上细胞不同时间段的增殖活性。 以上每个处理组每个时间点均设6个样品,采用SPSS13.0统计软件分析实验数据,析因方差分析检验各处理组和时间有无交互效应,多个样本均采用单因素方差分析(One-way ANOVA), Levene' test检验方差的齐性,方差齐则采用LSD样本均数间的两两比较,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,做Dunnett's T3多重比较。 3.将纯钛棒通过数控机床加工成为高7mm、底内直径为5mm的圆柱形钛帽20个,分别逐步在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声荡洗,持续时间为10min,室温下干燥后备用。将其中10个不做任何表面处理,其表面为机械光滑面,另外10个钛帽做微弧氧化处理,在表面形成微弧氧化膜,超声清洗后高压高温消毒后备用。将两组钛帽分别植入并固定在新西兰兔的颅顶骨,术后第四周处死兔子,切除颅顶骨获取实验标本。取出钛帽后测量每个钛帽内新生骨组织的最高点,处理数据后做统计学分析。采用3D微型CT扫描新生骨组织,将新生骨组织做图像重建,并计算新生骨组织的体积,所得数据做统计学分析。将样本骨块固定、脱水、做石蜡包埋后切片染色,在光学显微镜下观察新生骨的组织学形态。 将收集的新骨生长高点和新骨量的数据,通过SPSS13.0软件做t检验。统计后数据描述为均数加标准差(x±s),当P≤0.05时认为差异有统计学意义。 4.将纯钛棒通过数控机床加工制作成螺纹种植体长8mm,底内径2.6mm,底外径3.4mm,在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声荡洗10分钟,室温下干燥后备用。将其中10个不做表面处理,其表面为机械光滑面,设为光滑组。另外10个先采用激光蚀刻处理,在做微弧氧化处理。将两组钛种植体分别植入新西兰兔的胫骨的骺骨端,所有兔子均予四环素和钙黄绿素进行双色荧光示踪标记,处死前第13和14天连续两天皮下注射四环素,处死前第3和第4天予皮下注射钙黄绿素。术后第四周处死兔子,然后切取胫骨植入部位获得样本。将样本骨块固定、脱水、做塑料包埋后,带种植体骨块做切片。先通过荧光显微镜观察样本的荧光染色,采用Osteo Measure软件计算样本中荧光染色中,黄色条带和绿色条带的间距来计算骨矿化率(Mineralization rate)。再将样本通过亚甲基蓝—酸性品红染色,然后在显微镜观察下观察种植体与骨组织的成骨状况,通过计算种植体与骨组织接触的百分率评估骨结合情况,也就是骨结合指数(Osseointegration index, OI),骨结合指数OI=种植体与骨结合部分的长度/种植体-界面的总长度×100%。 将收集的新骨骨矿化率和骨结合指数的数据,通过SPSS13.0软件做t检验。统计后数据描述为均数加标准差(x±s),当P≤0.05时认为差异有统计学意义。 结果 1.各组钛表面的表面性质 (1)光滑面对照组,纯钛表面在电镜下显示十分光滑。 (2)激光处理组,激光处理后钛片表面形成规则的、大小和间距基本一致的微孔,表面微孔效果与预期基本一致,孔径约100μm,孔深为40~80μm。 (3)微弧氧化处理组,微弧氧化处理后钛片表面形成一层多层次多微孔氧化膜,其微孔孔径为1-5μm,微孔内还可见更小级别微孔,孔径小于1μm,微孔的周围类似火山丘状形貌。 (4)激光-微弧氧化处理组,钛片表面具有激光和微弧氧化两者的特点,电镜下其表面可见较大级别的微孔基本与激光处理后的形态相一致,孔径大小约100μm,孔深为40~80μm。微孔内表面也具有微弧氧化膜的多微孔结构特征,微观形态与微弧氧化组相似。扫面电镜下可见级别大微孔内含小级别微孔。 光滑组钛片表面的Ra值为179.23nm,微弧氧化膜表面的Ra值为1.55μm,通过X线衍射分析,发现光滑组和激光组的主要化学成分为钛,而微弧氧化组和激光-微弧氧化组均检测到Ti和TiO2(锐钛矿)。通过电子探针对每组钛表面的化学元素分析,发现光滑组表面为纯钛,激光组经过激光蚀刻后表面多了氧和碳元素。微弧氧化处理组和激光—微弧氧化处理组均检测出氧、钙、磷和碳元素,其中激光—微弧氧化处理组的碳元素含量比微弧氧化处理组的高,可见激光蚀刻处理和微弧氧化处理都会增加碳元素的含量。 2.细胞形态学观察、细胞增殖活性及分化水平的研究: (1)扫描电镜观察:1h时粘附于四组钛片上的细胞均较小,多为圆形;3h时细胞表面积有所增加,6h时和24h时表面细胞铺展开来,铺盖微弧氧化表面数个粗糙小孔;光滑钛片组表面细胞较为平铺,激光组、微弧氧化组、激光-微弧氧化组的钛片表面细胞伸出伪足,附着于膜层表面的孔洞边缘甚至于向孔洞内部延伸,铺盖于钛片表面凹凸不平之处。 (2)激光共聚焦显微镜观察:四组钛片上接种1h后的细胞肌动蛋白呈环状,包裹细胞核周围;3h时,四组钛片上细胞肌动蛋白更加明显,激光组、微弧氧化组、激光-微弧氧化组的钛片可见微丝束呈车轮状向四周放射;6h、24h时A组光滑钛片上微丝呈现长梭形,而微弧氧化B、C、D三组呈现典型多边形,尤其是D组,多向分化更加明显。 (3)MTS法比较四组的细胞增殖水平:细胞接种1d,四组钛片结果中,A、C、D三组之间统计学差异无意义;3d时,C、D两组增殖率大于A和B组,而C增殖率大于D,两组间差别有统计学意义(P0.001);5d时,D组增殖活性最大,与A、C、B三组之间差异有统计学意义(P0.001)。3.取下钛帽后,可以直接观察钛帽内部新骨的形成情况,实验组的新骨显然比对照组的多,实验组可见有较多的新骨沿着钛帽的内壁生长,而对照组的钛帽内却几乎没有见到新骨生长。实验组的钛帽内新骨生长最高点可达3.0mm,而对照组的则不超过0.7mm。样本颅顶的CT重建提示实验组的新生骨沿着钛帽内壁生长,而对照组几乎没有新增骨量。组织学切片可见骨小梁直接接触金属表面,沿着钛帽内壁生长,内壁上的骨质相对中央的骨质密度高,与CT的结果相一致。与对照组相比,实验组的新骨生长高点为2.63±0.28mm,显著高于对照组的,两组差异有显著统计学意义(P0.001)。实验组的新骨量达到18.63±3.80mm3,显著高于对照组的,两组差异有显著统计学意义(P0.001)。 4.光滑组种植体植入四周的荧光染色,黄色条带显色较细且远离种植体表面,靠近种植体表面的几乎为绿色条带,黄绿两条带的间距较小,种植体表面尚未见黄色条带直接接触,这提示着新骨组织的形成是从骨创面向种植体表面单向生长的,光滑组的黄绿色带的间距为5.6±0.93μm,通过计算得出其矿化速率为0.5±0.09μm/天。黄绿双色条带的间距小、矿化率小,提示着生长速度较慢。激光-微弧氧化组种植体植入四周的荧光染色,黄色条带显色较粗且直接与种植体表面接触,黄绿两条带的间距较大,这提示着新骨形成是从骨创面和种植体表面两个起点呈双向生长的,激光-微弧氧化组的黄绿色带的间距为10.78±0.68μm,从统计结果显示,两组间矿化速率的差异差有显著的统计学意义(P0.001),激光-微弧氧化组的矿化速率显著快于光滑组的(P0.001)。 植入四周后的种植体-骨界面,光滑组种植体螺纹内的表面可见新骨形成,骨小梁种植体表面沿着生长,其骨密度较小,种植体螺纹内可见新生骨与种植体表面接触较少。激光-微弧氧化组种植体螺纹内的表面可见新骨形成,骨小梁种植体表面沿着生长,其骨密度较大,且种植体螺纹内可见新生骨与种植体表面接触较多。从图上相比较显示,激光-微弧氧化组种植体表面新骨直接接触显著多于光滑组的。光滑组的骨结合指数为0.36±0.04%,激光-微弧氧化组的骨结合指数为0.61±0.06%。 从统计结果显示,两组间骨结合指数的差异差有显著的统计学意义(P0.001),激光-微弧氧化组的骨结合指数显著高于光滑组的(P0.001)。 结论 1.纯钛经激光蚀刻处理和微弧氧化处理分别具有各自的表面性质,两者方法相结合后,纯钛表面不仅可以形成激光处理获得的较大的多微孔特征,也具有经微弧氧化处理的微弧氧化膜的较小的多微孔性质,这种新形成的表面具有一定的粗糙度,富含钙、磷离子。 2.SEM和CLSM显示成骨细胞在钛片上随着时间的发展,发生有序、规律的粘附和伸展过程。粘附过程中的细胞形态及细胞骨架分布与钛表面结构、表面粗化程度相关。MTS显示成骨细胞在钛片上的增殖情况,第1天细胞完成粘附进入增殖初期C、D组增殖优势不显著。增殖中后期,D组增殖活性最强,这提示着激光-微弧氧化处理的表面具有良好的生物相容性。 3.微弧氧化膜上形成的新骨比较多,实验证明微弧氧化膜具有良好的骨引导性能,在没有任何骨替代材料的情况下,经过表面改性的钛表面有利于新骨生长,新生骨组织能沿着微弧氧化膜垂直生长,具有良好的垂直引导骨再生的能力。然而,有些表面处理方法对钛帽的内侧面做处理是很难做到的,因此,进一步的研究需要设计新的并且能使成骨最优化的钛装置。 4.激光蚀刻和微弧氧化处理后,种植体表面形成新的表面,具有弹坑状小孔和多微孔结构的二氧化碳膜,此外,还有一些钙磷成分的存在。新生骨组织对激光-微弧氧化处理的种植体的表面有更积极的反应,种植体在活体内能更快的与骨组织骨结合。所以,激光-微弧氧化处理作为种植体的表面处理方法是可靠的、有希望的。


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