收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立及中药的干预机制

彭菊  
【摘要】:研究背景 药物依赖一直以来都是全球广泛关注的一个话题,药物的滥用和毒品的广泛传播是导致药物依赖的主要原因。目前,阿片类药物是全球滥用情况最严重的药物之一,该药物滥用问题已成为一个世界公共卫生和社会问题。阿片类药物不仅能使人产生强烈的欣快感,同时还能有效的抑制呼吸、咳嗽中枢并具有兴奋神经中枢作用,而最令人头疼不已的是,阿片类成瘾后即使戒断,仍存在难以控制的戒断反应,造成吸食者出现不断的复吸,因此全球每年都有几十万人至几百万人因为吸食阿片类毒品而死亡。 现阶段针对阿片类药物成瘾的治疗方式主要有美沙酮、丁丙诺啡等的替代治疗及α2受体激动剂及镇静催眠类药物的非替代治疗,而中草药治疗作为一种非替代治疗方式,因其具有撤出容易,本身无成瘾性的优势,逐渐在成瘾治疗方面发挥重要作用。 大量研究表明,阿片类药物成瘾及戒断与阿片受体、谷氨酸受体及多巴胺受体的调控密切相关。μ阿片受体和δ阿片受体能共同介导阿片系统的奖赏效应,诱导动物产生条件性位置偏爱(CPP)行为。通过阻断多巴胺受体限速酶TH和NMDA受体在动物脑内的传递能改变阿片类药物引起的动物行为学的变化。因此,研究阿片类成瘾动物脑内阿片受体、谷氨酸受体及多巴胺受体的变化及变化趋势能够更深入的了解阿片类药物成瘾机制,为寻找阿片类戒断药物提供方向和依据。 目前判断动物成瘾的主要指标是观察其行为学上表现是否发生变化,条件性位置偏爱模型(CPP)是目前测定动物奖赏效应的最有效手段之一,也是评价药物精神依赖的有效方法。然而,目前国内利用CPP进行药物依赖的研究主要集中在大小鼠等啮齿动物模型,而少有利用其它模型来进行药物依赖研究的报道。而单一的动物模型往往不足以证明药物的确切效果,在研究过程中存在很大的局限性。因此,我们亟待寻找一种新的模型生物,并将其引入药物依赖研究领域,为将来成瘾治疗药物筛选提供多模型的支持。 斑马鱼(Danio rerio, zebrafish)是一种常见的热带观赏鱼,因其生长周期短,胚胎发育透明,产卵量多,易于饲养等众多优势被应用于医学研究。近年来,斑马鱼也越来越多的被应用于行为学研究领域,有研究表明,斑马鱼脑内也存在与啮齿动物相似的阿片受体及谷氨酸受体、多巴胺受体等,因此,利用斑马鱼动物模型进行阿片类药物依赖的研究具有极大的可行性。 实验目的 1.建立吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型,并对模型进行验证。在模型建立成功后,利用中药有效成分对吗啡依赖的斑马鱼进行干预,观察药物干预后斑马鱼行为学的变化。 2.采用q-PCR的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼脑内阿片受体水平的变化,并观察中药干预后,斑马鱼脑内相关受体水平的变化。 3.采用免疫组化的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼脑内TH和NR2B受体表达的变化,并观察中药干预后,相关受体表达水平是否发生改变。 4.利用斑马鱼胚胎验证中药有效成分青藤碱及阳性药美沙酮是否具有胚胎毒性,为青藤碱应用于临床戒毒提供毒理学的依据。 实验方法 1.吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立 自制CPP鱼缸(一缸为透明,一缸为褐色),褐色箱体部分为斑马鱼的偏爱箱,透明箱体部分为非偏爱箱(伴药箱)。取基线测定合格(斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间≥8min)的斑马鱼60条,称重,随机分为生理盐水组,30、40、50、60、90μg·g-1吗啡模型组,每组10条,雌雄各半。于正式实验d1测定斑马鱼15min内在CPP箱透明侧(非偏爱箱)的活动时间,并用Noldus EthoVisionXT8.5软件追踪斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹(5min)。于实验d2、d4、d6斑马鱼腹腔注射各浓度吗啡(空白组注射生理盐水),将其放入伴药箱内40min。d3、d5同一时间斑马鱼腹腔注射与吗啡同体积生理盐水,将其放入偏爱箱内40min。在末次给药24h后即d7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间并比较训练前后各条斑马鱼在伴药箱活动时间的差值,并分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹及运动总路程。 2.中药有效成分青藤碱对吗啡诱导的斑马鱼药物依赖的干预 取基线测定合格的斑马鱼50条,称重,随机分为生理盐水组,吗啡模型组,吗啡+美沙酮组(40μg-g-1),吗啡+青藤碱低剂量组(40μg·g-1),吗啡+青藤碱高剂量组(80μg-g-1),每组10条,雌雄各半。给药方法同造模给药。于每日造模给药12h后,青藤碱高低剂量组和美沙酮给药组斑马鱼分别注射各浓度药物,生理盐水组和模型组注射同体积生理盐水。末次给药12h后即d7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间并比较训练前后各条斑马鱼在伴药箱活动时间的差值,同时分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹及运动总路程。 3.青藤碱对吗啡依赖斑马鱼脑内阿片受体和TH、NR2B表达的影响 各组斑马鱼行为学指标检测结束后,斑马鱼迅速冷冻处死,显微镜下取脑组织。采用q-PCR技术检测各组斑马鱼脑组织中zfinor、zfdor1、zfdor2mRNA的表达;免疫组化方法检测各组斑马鱼脑内TH和NR2B受体的表达。 4.青藤碱及美沙酮对斑马鱼胚胎的心脏毒性研究 收集斑马鱼胚胎,孵育48h。将48hpf的胚胎随机分组放入24孔板中,每孔8枚胚胎。按预实验结果设定青藤碱1000、500、300、200、100mg/L浓度组和美沙酮1000、500、300、200、100mg/L浓度组以及胚胎培养液空白对照组,每组取24孔板两孔共16枚胚胎。按上述浓度进行给药后12h和24h体式显微镜下观察各组胚胎心包及心脏形态,并记录其心率。整个实验重复进行3次,每次实验用同一批斑马鱼胚胎。 5.统计方法 统计结果均采用x±s的形式表示,采用spss17.0统计学软件进行处理,多组间数据比较采用单因素方差分析,方差齐时用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3进行检验,同组数据比较用配对样本t检验。以P0.05表示有统计学差异。 实验结果 1.以腹腔注射给药的方式,各组斑马鱼训练之前在伴药箱的活动时间无明显差异(P0.05),而注射吗啡并进行连续3次训练后,40、50、60μg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的活动时间比训练前均明显增加(P0.05),而40、50gg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱活动时间的差值与生理盐水组比较有显著差异(P0.01)。比较斑马鱼5min内在伴药箱中的运动总路程,各组斑马鱼训练前在伴药箱中的运动路程无明显差异,而训练后,40、50gg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的总路程明显延长(P0.01),表明腹腔注射40-50gg·g-1吗啡并对斑马鱼进行连续3次训练能够诱导其条件性位置偏爱的形成。记录斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹,注射40μg·g-1吗啡后斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹明显增多,而空白组斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹训练前后无明显变化。 2.青藤碱干预吗啡依赖的斑马鱼后,40μg·g-1吗啡模型组斑马鱼造模前后在伴药箱中的活动时间差值与空白组相比,差异具有显著性意义(P0.05)。而青藤碱高剂量(80μg·g-1)组和美沙酮(40μg·g-1)组训练前后在伴药箱中的活动时间的差值与模型组相比有显著性差异;与空白组相比,差异无显著性意义。 3. q-PCR结果发现,模型组斑马鱼脑内μ阿片受体(zfmor)和6阿片受体(zfdorl和zfdor2)的相对表达量,与空白组相比,均显著降低(P0.05),表明连续注射吗啡能抑制斑马鱼脑内阿片受体的表达。而注射给予斑马鱼美沙酮或不同剂量青藤碱后,发现80μg·g-1的青藤碱能使斑马鱼脑内zfmor、zfdor1、 zfdor2的表达均上调,与吗啡模型组相比,差异具有统计学意义(P0.01),而40μg·g-1的青藤碱能使zfmor的表达上调,恢复成正常水平,但zfdorl和zfdor2的表达与模型组相比,无显著性差异。 4.免疫组化结果表明,模型组斑马鱼脑内TH和NR2B蛋白的表达与空白组相比显著增加,提示吗啡通过调控斑马鱼脑内TH和NR2B的水平来诱导成瘾。80μg·g-1的青藤碱和美沙酮干预后,斑马鱼脑内TH和NR2B表达显著降低,表明青藤碱可能通过抑制斑马鱼脑内部分谷氨酸受体及多巴胺受体的表达来抑制成瘾。 5.利用系列剂量美沙酮处理48hdf斑马鱼胚胎后,1000mg/L、500mg/L组斑马鱼胚胎在给药12h后全部死亡,而300mg/L、200mg/L斑马鱼胚胎也出现部分死亡,存活斑马鱼给药12h、24h后心率与空白组相比,均显著降低。100mg/L美沙酮处理40hdf斑马鱼胚胎后,未出现死亡,心率与空白组相比,也无显著性差异。系列剂量青藤碱处理48hdf斑马鱼胚胎,结果各剂量组斑马鱼胚胎在给药后12h、24h心率与空白组相比,差异均无显著性意义,斑马鱼心脏区域也未出现心包肿大、心区淤血堆积等现象,该结果表明青藤碱对斑马鱼心脏无明显毒性。 结论 1.本研究中斑马鱼经过连续3次注射吗啡(40-50μg·g-1),其训练前后在伴药箱中的活动差值及运动路程、运动轨迹与空白组相比均明显增多,表明吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型构建成功,也证明斑马鱼能够成功用于药物依赖方面的研究。 2.青藤碱高剂量组(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g1)干预均能抑制吗啡诱导的条件性位置偏爱,使斑马鱼在伴药箱中停留时间显著降低,表明美沙酮和高剂量的青藤碱均能有效抑制吗啡依赖引起的斑马鱼行为学的变化。而低剂量(40μg·g-1)的青藤碱不能引起吗啡依赖斑马鱼行为的显著变化。 3.连续3次注射吗啡能使斑马鱼脑内zfinor、zfdor1、zfdor2的表达下调,而青藤碱高剂量(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g-1)的干预能抑制吗啡依赖引起的zfinor、zfdor1、zfdor2表达下调,但是低剂量的青藤碱不能产生明显的抑制效果。 4.斑马鱼吗啡依赖也可能与其脑内TH和NR2B的表达改变有关,而青藤碱能够抑制这种改变从而戒断毒瘾。 5.青藤碱各剂量组处48hdf斑马鱼胚胎后,其给药后12h、24h心率与空白组相比,均无显著性变化,表明青藤碱并无明显的斑马鱼胚胎毒性,正常剂量的青藤碱能够运用于吗啡依赖的戒断。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 夏一梦;王英伟;;用斑马鱼研究胎儿酒精综合征的进展[J];上海交通大学学报(医学版);2008年04期
2 王思锋;刘可春;王希敏;何秋霞;韩利文;侯海荣;;雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究[J];中国药理学通报;2009年05期
3 徐娟;吴南翔;;斑马鱼在环境内分泌干扰物筛选和检测中的应用[J];国外医学(卫生学分册);2009年04期
4 谢菲;陈晗;李建明;丁彦青;;斑马鱼在肿瘤研究中的应用[J];中国热带医学;2009年06期
5 何秋霞;刘可春;楚杰;王思锋;韩利文;王希敏;;斑马鱼作为模式生物在心血管疾病研究中的应用[J];生命的化学;2009年05期
6 方薇;曾静;王付利;;模式生物斑马鱼在人类疾病研究中的应用[J];医学信息(中旬刊);2010年02期
7 李乙根;黄文瑾;黄诚;;斑马鱼在新药发现中的应用[J];生命科学;2011年03期
8 张勇;陈芳源;邓敏;;斑马鱼血液肿瘤学的研究进展[J];遗传;2009年09期
9 李亚;王伦安;王玉明;杨平;潘克俭;黄明孔;;斑马鱼rnf141基因结构与表达分析[J];第二军医大学学报;2008年08期
10 曾怀才;贺庆芝;贺性鹏;;氯化三丁基锡对斑马鱼胚胎发育的影响[J];中国职业医学;2010年01期
11 张立凤;钟涛;桂永浩;;外源性视黄酸对斑马鱼心血管系统发育的影响[J];中国实验动物学报;2006年02期
12 牛荣丽;阎松;杜长青;林秀坤;;抗肿瘤新药研究的新型模式生物斑马鱼[J];中国新药杂志;2006年07期
13 李谨;王涛;王娟;詹瑧;;Pitx2基因在斑马鱼牙齿发育过程中早期表达的研究[J];口腔医学;2010年03期
14 王涛;王娟;李谨;;Pax9基因在斑马鱼早期发育阶段腮弓中的表达[J];口腔医学研究;2010年03期
15 孙淑娜;桂永浩;蒋璆;钱林溪;宋后燕;;二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用[J];中国实验动物学报;2010年02期
16 钟敏;沈莉菁;陈芳源;张勇;匡颖;钟华;钟济华;;MYCN转基因斑马鱼对造血调控因子的影响[J];诊断学理论与实践;2011年02期
17 王菊;赵建军;马旭;;丙烯酰胺对斑马鱼胚胎发育过程中microRNA表达的影响[J];毒理学杂志;2007年03期
18 梁爱华;;斑马鱼——一种可用于中药药效和毒性筛选的鱼类模型[J];中国中药杂志;2009年22期
19 韩勇军;吴新荣;;ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达[J];第三军医大学学报;2011年04期
20 张立凤;桂永浩;钟涛;王跃祥;蒋球;崇梅;孙淑娜;宋后燕;;视黄酸影响斑马鱼胚胎心脏房室分化[J];复旦学报(医学版);2007年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 鲍清;张乐;廖雪;;斑马鱼胚胎筛选致畸药物之方法探索[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
2 张乐;鲍清;廖雪;;斑马鱼胚胎致畸药物筛选试验[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
3 许海;杨明;吴明红;;双酚A和壬基酚对斑马鱼胚胎毒性研究[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
4 于永利;杨景峰;王思珍;董武;;高残留农药福美双对斑马鱼胚胎体节以及脊索的影响[A];持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2010年
5 张利军;史慧勤;彭双清;;基于斑马鱼模式动物的阿霉素心脏毒性作用研究[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
6 史慧勤;张利军;彭双清;;应用模式动物斑马鱼观察异烟肼的一般毒性作用[A];2010年全国药物毒理学学术会议论文集[C];2010年
7 闫峻;胡传禄;张华山;杨红莲;田蕾;林本成;林治卿;袭著革;;纳米二氧化钛与双酚A复合污染物对斑马鱼胚胎的联合毒性效应研究[A];中国毒理学会环境与生态毒理学专业委员会第二届学术研讨会暨中国环境科学学会环境标准与基准专业委员会2011年学术研讨会会议论文集[C];2011年
8 巴雅斯胡;杨景峰;于永利;王思珍;董武;;高残留农药代森锌诱导斑马鱼胚胎脊索变形[A];持久性有机污染物论坛2011暨第六届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2011年
9 刘春生;周炳升;张效伟;李广宇;;内分泌干扰物丙基硫氧嘧啶对斑马鱼胚胎的旁观者效应[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
10 徐挺;张洪昌;赵静;郭雪萍;尹大强;;五氯酚对斑马鱼胚胎早期发育基因表达谱影响的研究[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 金美青;典型手性农药拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼的发育毒性研究[D];浙江大学;2010年
2 高珊;胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究[D];复旦大学;2009年
3 刘少颖;三唑酮对斑马鱼的胚胎发育和内分泌—生殖毒性[D];浙江大学;2011年
4 常菊花;丁草胺对斑马鱼的内分泌干扰效应研究[D];南京农业大学;2012年
5 竺林;激活诱导胞嘧啶脱氨酶基因在斑马鱼中的功能研究[D];中国农业大学;2014年
6 普佳睿;神经调节素1在斑马鱼肠神经系统发育中的作用[D];华中科技大学;2013年
7 王倩;斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2014年
8 张利军;斑马鱼心脏毒性评价模型的建立及美托洛尔心脏毒性作用机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年
9 宋扬;以斑马鱼为模型研究神经靶酯酶的功能及其在神经退行性疾病发生中的作用机制[D];山东大学;2012年
10 李雷;斑马鱼AGGF1基因在造血系统以及血管系统发育过程中的功能研究[D];华中科技大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王稼农;用于药物安全性评价的斑马鱼生物技术平台建设研究[D];广西医科大学;2010年
2 丁丽丽;力达霉素抑制斑马鱼胚胎血管生成的实验研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2010年
3 周瑞芳;凝血因子Ⅲb在斑马鱼胚胎发育中的作用[D];复旦大学;2011年
4 向霄;环境雌激素与抗雌激素对斑马鱼胚胎的复合效应研究[D];上海交通大学;2012年
5 蒲韵竹;斑马鱼阿尔茨海默病动物模型的建立[D];西南大学;2013年
6 梁荣朝;丙烯酰胺对斑马鱼生物余能的影响及对其肝、鳃毒性的作用[D];哈尔滨商业大学;2013年
7 邵潘柱;三-(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯对斑马鱼雄性生殖和胚胎的毒性研究[D];东华大学;2014年
8 逯娟;莠去津对斑马鱼生殖发育影响的研究[D];河北大学;2009年
9 谭敏卿;菲和高氯酸钠对斑马鱼的毒性效应[D];哈尔滨工业大学;2011年
10 秦帅;活体高通量筛选抑制斑马鱼巨噬细胞迁移的中药[D];贵阳中医学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 许琦敏;刘廷析 “掘宝”斑马鱼世界[N];文汇报;2011年
2 本报记者 滕继濮;小小斑马鱼 大大有用处[N];科技日报;2010年
3 刘霞;美发现鱼鳍向四肢进化的关键基因[N];科技日报;2010年
4 张田勘;基因致水生动物从鳍到腿演变[N];大众科技报;2010年
5 孙国根;复旦大学发现GRK在胚胎发育中的新功能[N];中国医药报;2009年
6 孙国根 记者 王春;我科学家发现GRK在胚胎发育中的新功能[N];科技日报;2009年
7 罗刚 李兵;斑马鱼破译人类基因的先锋[N];健康报;2004年
8 记者 毛黎;2008年10大科学突破[N];科技日报;2008年
9 张忠霞;美《科学》杂志评出今年十大科学进展[N];大众科技报;2008年
10 记者 冯卫东;研究人员发现可破坏肿瘤抑制基因的小RNA[N];科技日报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978