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血小板输注无效检测策略的建立及临床应用

伍伟健  
【摘要】:目的 血小板输血是现代成分输血的重要组成部分。随着临床输血事业的发展,血小板的使用日益广泛,伴随而来的血小板输注无效(platelet transfusion refractory, PTR)相当棘手。因为一旦发生PTR,寻找相合的血小板非常困难。如何为血小板输注无效患者选择最佳匹配血小板进行输注,减少输注无效症的发生,提高血小板输注疗效,成为目前临床输血工作急需解决的难题。同种免疫性抗体(Platelet alloantibodies, PT Allo-Ab)的产生是导致血小板输注无效的重要原因。为血小板输注无效患者选择最佳匹配血小板进行输注,减少输注无效症的发生,提高血小板输注疗效,成为目前医学界研究的热点之一。本研究重点探讨佛山地区血小板输注无效患者血小板抗体特异性、血小板抗体阳性率及相关因素,为制定血小板输注策略提供参考;初步掌握佛山地区无偿血小板捐献者HLA-Ⅰ(A,B位点)和HPA-1~5,15基因分布情况,并建立佛山地区无偿血小板捐献者HLA-Ⅰ(A,B位点)和HPA-1~5,15基因供血者信息库;探索和建立一种适用于佛山地区临床客观情况的免疫抗体致血小板输注无效检测策略与技术路线,经济、快捷、准确地为含血小板同种异体抗体的受血者寻找到相合的血小板,提高血小板的输血效果,并建立相关的检测及配血流程,初步为临床解决PTR这一输血难题。 方法 1.采用固相凝集法检测2012年1月至2013年8月期间,佛山地区各医院收治并送检的55例PTR患者血清中的HLA-Ⅰ抗体、HPA抗体及血小板自身抗体。计算血小板同种抗体阳性检出率,HLA、HPA抗体及血小板自身抗体阳性率,并对血小板抗体阳性率相关因素(性别、年龄)进行统计学分析。 2.采用PCR-SSP法对佛山地区无偿机采血小板捐献者600人进行HLA-Ⅰ(A,B位点)基因分型,并且对其中随机100人进行HPA-1~5,15基因分型。收集献血者相关信息,使用EXCEL软件,建立HLA、HPA供血者信息库。数据库内容包括:血小板供血者姓名、性别、年龄、身份证件号、ABO、Rh血型、联系方式等;供血者既往的献血记录(包括每次献血的时间、血液成分种类、献血量等);供血者HLA-Ⅰ(A,B位点)、HPA-1-5,15基因分型结果。 3.采用PCR-SSP法对2012年1月-2013年10月佛山地区各医院送检的30名PTR患者进行HLA-Ⅰ(A,B位点)基因、HPA-1~5,15基因分型。 4.使用3种不同检测策略(HLA/HPA供血者配合输注策略、血小板交叉配血试验配合输注策略、随机输注血小板策略)为血小板输注无效患者提供血小板,并比较其输血效果:(1)比较前2组获得相合供血者的百分率;(2)比较3组血小板输注有效率。(3)比较前2组每次配血平均实验时间。(4)比较前2组每次配血平均费用。 5.相关数据的计算及统计方法 5.1血小板抗体检测结果计算及统计学方法 (1)血小板抗体阳性检出率的计算:HLA抗体阳性率=HLA抗体阳性标本数/总标本数;HPA抗体阳性率=HPA抗体阳性标本数/总标本数;血小板自身抗体阳性率=血小板自身抗体阳性标本数/总标本数。 (2)比较男性患者组与女性患者组的血小板抗体阳性率,采用,检验,以P0.05为差异有统计学意义。 (3)将患者按输血次数为2-3、4-6、7-10、10,分成4组,对各组患者的血小板抗体阳性率作卡方趋势检验,以P0.05为趋势检验有统计学意义。 5.2HLA、HPA基因频率和基因型频率的计算基因频率=基因数/总基因数基因型频率=基因型数/总基因型数 5.3血小板输注效果评价参数的计算:血小板校正增值计数指数(CCI)=[输注后血小板计数(109/L)-输注前血小板计数(109/L)]×体表面积(m2)/输入血小板总数(1011),体表面积=0.0061×身高(cm)+0.0128x体重(kg)-0.01529;血小板回收率(PPR)=[输注后血小板计数(109/L)-输注前血小板计数(109/L)]×血容量(L)/[输入血小板总数(1011)x2/3],血容量以男性每kg体重69mL,女性每kg体重65mL计算。输入血小板总数按每袋机采血小板实际数量计算。 5.4血小板输注无效的检测及检测策略效果比较的统计学方法 (1)前2组获得相合供血者的百分率比较采用χ2检验,以P0.005为差异有统计学意义。 (2)三组检测策略的输注有效率比较采用χ2检验,以P0.05为差异有统计学意义。 (3)前2组检测策略的平均实验时间比较采用t检验,以P0.05为差异有统计学意义。 (4)前2组检测策略的平均费用比较采用t检验,以P0.05为差异有统计学意义。 结果 1.PTR患者血小板同种抗体阳性检出率为58.2%(32/55),其中同种HPA抗体阳性率为21.8%(12/55),同种HLA抗体阳性率为50.9%(28/55),在检出血小板同种抗体的患者中,抗-HLA抗体的患者占87.5%(28/32);在检出HPA抗体的患者中有66.7%(8/12)的患者同时检出HLA抗体。检出4例PLT自身抗体,阳性率为7.3%(4/55)。女性患者中血小板抗体阳性率为60.61%(20/33),略高于男性的54.5%(12/22),但两者比较差异无有统计学意义(χ2=0.01,P0.05)。血小板抗体阳性率随输血次数增加而呈增高趋势(χ2趋势=13.14,P0.05),以输血次数为4-6次时增幅最大。 2.无偿血小板捐献者HLA-Ⅰ(A,B位点)基因分型结果:600份无偿血小板捐献者样本中共检出HLA-A位点等位基因14个,较常见的基因为A*2、A*11和A*24,基因频率分别为0.3000,0.1792,0.1708;HLA-B位点等位基因27个,较常见的基因为B*40、B*15、B*13、B*46、B*51、B*58,基因频率分别为0.1592、0.1275、0.1000、0.0858、0.0692、0.0692。 3.建立了佛山地区无偿血小板捐献者HLA-Ⅰ(A,B位点)基因供血者信息库。数据库内容包括:血小板供血者姓名、性别、年龄、身份证件号、ABO、Rh血型、联系方式等;供血者既往的献血记录(包括每次献血的时间、血液成分种类、献血量等);供血者HLA-Ⅰ(A,B位点)基因分型结果。 4.无偿血小板捐献者HPA-1~5,15基因分型结果:100名佛山地区无偿血小板捐献者HPA-1~5、15基因型频率如下:HPA-1aa:0.9600, HPA-1ab:0.0400, HPA-lbb:0.0000, HPA-2aa:0.8900, HPA-2ab:0.1100, HPA-2bb:0.0000,HPA-3aa:0.3100, HPA-3ab:0.5200, HPA-3bb:0.1700, HPA-4aa:0.9900, HPA-4ab:0.0100, HPA-4bb:0.0000,HPA-5aa:0.9500, HPA-5ab:0.0500, HPA-5bb:0.0000, HPA-15aa:0.2100, HPA-15ab:0.5400, HPA-15bb:0.2500,在无偿血小板捐献者中常见的基因型为:HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3ab、HPA-4aa、HPA-5aa、 HPA-15ab,基因型频率分别为:0.9600、0.8900、0.5200、0.9900、0.9500、0.5400。研究数据显示,佛山地区无偿血小板捐献人群HPA-3、HPA-15具有较高的杂合度(杂合子基因型频率分别是0.5200和0.5400);HPA-1,2,4,5以a/a纯合子基因型为主,频率分别为0.9600,0.8900,0.9900,0.9500,没有b/b纯合子出现;HPA-3,15发现b/b纯合子基因型,频率分别为0.1700,0.2500。 5.建立了佛山地区无偿血小板捐献者HPA-1~5,15基因供血者信息库。内容包括:血小板供血者姓名、性别、年龄、身份证件号、ABO. Rh血型、联系方式等;供血者既往的献血记录(包括每次献血的时间、血液成分种类、献血量等);供血者HPA-1~5,15基因分型结果。 6.30名PTR患者HLA-I(A,B位点),HPA-1~5,15基因分型结果:共检出HLA-A位点等位基因6个,较常见的基因为A*2和*A11,基因频率分别为0.3167、0.2667; HLA-B位点等位基因12个,较常见的基因为B*40和B*46,基因频率分别为0.2500、0.1667。HPA-1~5,15常见的基因型为:HPA-1aa、 HPA-2aa、HPA-3ab、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15ab,基因型频率分别为:0.9667、0.8667、0.5333、1.0000、0.9333、0.5667。 7.建立了血小板输注无效患者的检测策略及技术路线。本项研究建立的是一种基于血小板抗体检测技术及HLA-I(A,B位点)、HPA-1~5,15基因分型的检测策略与技术路线:先对血小板输注无效患者进行血小板同种异体抗体筛查,阳性者进行血小板同种异体抗体特异性检测,分出是HLA抗体还是HPA抗体,相应地对患者HLA及HPA进行基因分型,根据分型结果在HLA/HPA基因库中选择合适供血者,输注经上述方法选择出的供血者血小板。 8. HLA/HPA供血者库和血小板交叉配血试验的配合输注策略,获得相合供血者率分别为100%、80%;HLA/HPA供血者库、血小板交叉配血试验和随机输注血小板策略的输注有效率为分别100%、62.5%、10%,前两者间及前两者分别与后者比,均有显著性差异(P0.05);HLA/HPA供血者库和血小板交叉配血试验的配合输注策略,平均实验时间分别为7.5±1.6h、13.3±6.1h,两者有显著性差异(P0.05);平均费用分别为365±47元、696±343元,两者有显著性差异(P0.05)。 结论 1.佛山地区PTR患者中血小板同种抗体以HLA抗体多见,其次为HPA抗体,少数患者还存在血小板自身抗体;血小板同种抗体阳性率随输血次数增加呈增高趋势,以输血次数为4-6次时增幅最大。血小板同种抗体阳性率与患者性别无关。临床上应尽量减少输血次数以减少PTR的发生。 2.初步建立佛山地区无偿血小板捐献者HLA-Ⅰ(A,B位点)基因供血者库。 3.初步建立佛山地区无偿血小板捐献者HPA-1~5,15基因供血者库 4.建立一种基于血小板抗体检测技术及HLA-Ⅰ(A,B位点)、HPA-1~5,15基因分型的检测策略与技术路线,是适用佛山地区临床客观情况的解决血小板输注无效这一输血难题的有效策略和技术路线。 5. HLA/HPA供血者库配合策略比血小板交叉配血试验配合策略更容易寻找到相合的供血者,输注有效率高,输血效果良好,是为佛山地区血小板输注无效患者寻找相合血小板的理想策略,建议在临床输血中推广使用。


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