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炎性因子对人牙周细胞表达Asporin影响的实验研究

胡娇  
【摘要】:研究背景 牙周炎是一种侵犯牙周支持组织的炎症性和破坏性疾病,其主要特征为牙龈及牙周膜胶原纤维溶解破坏,牙周附着丧失,牙槽骨吸收,最终导致牙齿松动脱落,跟癌症和心血管疾病一样严重威胁人类健康,因此明确各种宿主因素在牙周炎发生发展过程中所扮演的角色,对了解牙周炎病因及病理生理机制就显得尤为重要。 牙周炎的发病机制错综复杂,是近年来学者深入研究探讨的课题之一,细菌是牙周炎的始动因素,除全身易感因素外,细胞因子的作用不容忽视。学者认为牙周炎主要是通过致病因子引发的宿主免疫和炎症反应失调所造成的间接损害。多种炎性因子形成细胞因子网络,大多参与牙槽骨破骨与成骨、牙周组织破坏与修复过程。其中在破骨前体细胞分化成成熟破骨细胞过程中,促进破骨细胞分化的有白细胞介素1β (Interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor-a, TNF-α)、IL-17和抑制破骨细胞分化促进成骨的IL-10、转化生长因子β(Transforming growth factor, TGF-P)等。 白细胞介素1(IL-1)主要由单核-吞噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞等诱导产生,具有促炎功能,可分解、代谢、促进前列腺素E2合成,激活破骨细胞,促进破骨细胞合成导致骨吸收。并可促进体质内的间质细胞诱导产生金属蛋白酶,导致基质中的胶原降解、破坏。有研究表明,在炎症部位的龈沟液中,IL-1活性明显高于健康部位,IL-1的量也与牙周袋的深度呈正相关关系。其中龈沟液中IL-1p的水平与慢性牙周炎的严重程度密切相关。IL-1p是一种多效性细胞因子,具有广泛的细胞免疫调节作用,包括促进胸腺细胞和T细胞增殖和分化,刺激破骨细胞和胶原酶,促进破骨细胞形成和骨吸收,最终导致骨和牙周结缔组织破坏,牙周组织修复能力丧失等。 TNF-α主要由被G-细菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)激活的巨噬细胞产生,对白细胞、血管内皮细胞及结缔组织中多种细胞具有广泛的生物学效应,并可活化前破骨细胞使之分化成熟为破骨细胞,促进骨吸收,还可增强血管通透性,具有促炎作用。 IL-8是中性粒白细胞强有力的趋化因子,可聚集并激活中性白细胞,使其释放溶菌酶,Gamonal等研究发现,IL-8在正常牙龈组织和牙周炎患者牙龈组织中均有表达,但在病变牙龈组织中明显高于正常牙龈组织,且经治疗后显著下降。并有研究发现IL-8可以刺激RANKL mRNA表达和破骨细胞生成,促进骨吸收。 IL-17作为一种促炎症性细胞因子,可以与受体特异性结合,有促进炎症反应、免疫应答、造血等多种作用。并可刺激成纤维细胞释放IL-6、IL-8、前列素E2(Prostaglandin E2, PGE2)等,诱导巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α等,抑制IL-10的生成,促进骨吸收。 转化生长因子β(TGF-β)是一种多功能的细胞活性调节因子,具有调节机体的免疫应答、炎症反应功能,与组织修复密切相关。在慢性牙周炎发生发展过程中,TGF-β参与了牙周组织炎症的免疫反应和软硬组织的再生修复,影响着牙周疾病的发展速度和愈合过程。 Asporin (ASPN)也叫牙周膜相关蛋白(periodontal ligament associated protein1, PLAP1),是小富亮氨酸重复序列蛋白多糖(small leucine-rich proteoglycans, SLRPs)家族中的一员,此家族成员还有二聚糖(Biglycan),核心聚糖(Decorin),fibromodulin, lumican等。SLRPs可以和许多不同的细胞因子、表面受体、生长因子结合达到调节细胞的功能。如Toll样受体、TGF-β、骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein-4, BMP-4)等。现有的研究表明SLRPs在调节胶原纤维的形成,组装和降解过程中扮演着重要角色。SLRPs与胶原纤维和弹性纤维结合,可以增强纤维的稳定性,保护纤维不被各种胶原酶降解。 Asporin是2001年发现的SLRPs家族新成员,与其他成员一样它具有亮氨酸重复序列,不同的是Asporin不是严格意义的蛋白多糖,其氨基末端有个独特的天门冬氨酸残基重复区域,Loughlin J发现Asporin天门冬氨酸残基量D14等位基因与骨关节炎易感性显著相关。Sebastian K等对细胞外基质的相互作用研究结果显示Asporin与Decorin相互竞争,直接影响成骨细胞胶原矿化。Kei等报道Asporin在骨关节炎发病机制中抑制TGF-β成软骨和骨重构功能,从而抑制成骨。Yamada等报道Asporin对牙周组织中的胶原纤维同样发挥着调节作用,并且抑制BMP-2的活性从而抑制成骨。然而Wang L等报道Asporin促进钙离子结合参与矿化过程,并能影响羟基磷灰石晶体形成。促进成骨细胞胶原矿化。Eun-hyang Lee等用免疫组化的方法研究发现Asporin在前期牙本质和牙本质界高表达,并且人牙髓干细胞矿化早期高表达,后期低表达,从而表明Asporin在人牙髓干细胞矿化过程中起重要作用。 Asporin在骨关节炎的软骨中高表达并呈多态性表达,在抑制成骨的机制中会不会有炎性细胞因子的调节作用呢?Elise Duval等在骨关节炎的细胞中检测细胞因子对Asporin表达的调节作用,结果显示IL-1p和TNF-a下调Asporin的表达而TGF-β上调Asporin的表达。 目前Asporin已证实在正常牙周组织中高表达,在牙周炎牙周组织中表达是否有变化尚未见报道,Asporin是否参与了牙周炎的致病过程?如何行使其功能?牙周炎致病机制中的重要细胞因子在牙周膜细胞中是否对Asporin表达有调节作用?本课题通过检钡IL-1β, TNF-α, TGF-β, IL-17, IL-8等炎性因子对牙周膜细胞表达Asporin的影响,探索Asporin在牙周炎的发生及发展过程中所扮演的角色。 本论文分为以下三部分内容 第一部分hPDLCs的分离培养与鉴定 通过收集临床新鲜拔除的健康智齿或正畸需要拔除的前磨牙,刮取根中牙周膜组织,利用组织块预消化法法分离培养hPDLCs,通过检测其生长曲线,矿化能力,胶原表达情况以及流式细胞鉴定间充质表面标记物,证实为牙周膜细胞,为后续实验提供了可靠的细胞来源。 第二部分Asporin在牙周组织中的表达 通过临床收集健康人牙周组织,利用免疫组织化学方法检钡Asporin在牙周组织中的表达。并利用RT-PCR检钡Asporin在hPDLCs中的表达,用免疫细胞化学方法对其进行定位,为后续实验建立基础。 第三部分炎性因子对hPDLCs表达Asporin的影响 通过qRT-PCR检测分别用0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的IL-1β, TNF-α, TGF-β, IL-17, IL-8诱导hPDLCs后Asporin的表达情况。根据实验结果选定各炎性因子的浓度,并通过qRT-PCR检测各炎性因子诱导hPDLCs3,6,24,48h后Asporin的表达,采用免疫细胞化学和western blot方法检测其蛋白水平的变化,探索Asporin在牙周炎的发生及发展过程中起怎样的调节作用。 材料与方法hPDLCs的分离培养 收集临床新鲜拔除智齿或正畸需要拔除的前磨牙,年龄25岁以下,无龋坏及牙周炎症感染,放入DMEM培养基中4℃保存,4h内用组织块酶消化法进行体外培养。无菌PBS液冲洗三次,刮取牙根中1/3处牙周膜,PBS液冲洗三次后剪碎,0.2%I型胶原酶消化10min,完全培养基洗涤组织块,离心,将组织块均匀接种在培养瓶的培养面上,置于37℃5%CO2的孵箱中培养24h后,加入完全培养基覆盖组织块,继续培养。细胞生长至培养底面的80%后,以1:3的比例传代扩大培养,第三到五代细胞用于实验。 MTT 将三到五代hPDLCs以2×103/孔的密度接种于96孔板,每次5个重复孔,1-8d每天同一时间M酶标仪测定490nm波长下各孔OD值,统计分析并作生长曲线图。 RT-PCR 提取细胞总RNA,逆转录成cDNA后,进行普通PCR扩增、电泳显影、紫外线拍照。 茜素红染色 取对数生长期的细胞,矿化诱导14d后,4%多聚甲醛固定20min,茜素红染色10min。倒置显微镜下观察矿化结节形成情况。流式细胞术检测细胞表面标记物 取第3代对数生长期的细胞,消化,1×105个细胞重悬于含有0.1%BSA冰的PBS缓冲液中,用CD2、CD44、CD90、CD105抗体冰上避光孵育1h,用含有0.1%BSA预冷的PBS清洗,流式细胞仪检测标记物阳性率。 免疫组织化学 临床收集健康牙周组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,常规脱蜡至水,抗原修复,血清封闭,Asporin一抗、二抗室温孵育,DAB显色,苏木素复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。正置显微镜拍照。 qRT-PCR 使用Trizol提取牙周膜细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR green法进行荧光定量实时PCR扩增,通过相对定量法计算2-ddCt值,检测基因的相对表达情况。 免疫细胞化学 多聚甲醛固定细胞,0.2%Triton X-100室温孵育,正常山羊血清室温封闭,Asporin一抗、二抗室温孵育,DAB显色,苏木素复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。正置显微镜拍照。Image-Pro Plus (IPP)软件测其density(IOD/area)值。 Western blot 蛋白裂解液获取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳、转膜、抗体孵育、显影及定影。 结果 1.本实验利用组织块酶消化法成功分离培养hPDLCs,培养的细胞呈长梭形,其生长曲线图符合细胞生长规律,具有成骨能力,Ⅰ型胶原表达阳性、Ⅳ型胶原表达弱阳性,取材于牙周膜组织,认定为hPDLCs。 2.免疫组织化学和免疫细胞化学结果显示Asporin高表达于人牙周组织和hPDLCs中,其主要定位于细胞胞质中,胞核中未见表达 3. qRT-PCR结果显示1ng/mL的TNF-α10ng/mL的IL-1β、5ng/mL的IL-17和IL-8能最大程度下调Asporin的表达(P0.01),5ng/mL的TGF-β最大程度上升Asporin的表达(P0.01)。 4. qRT-PCR、免疫细胞化学、Western blot结果显示1ng/mL的TNF-α、l0ng/mL的IL-1β、5ng/mL的IL-17诱导24、48h后Asporin表达明显下降,5ng/mL的IL-8诱导48h后Asporin表达明显下降,5ng/mL的TGF-p诱导24h后Asporin表达明显上升。 结论 1.利用组织块预消化培养法成功分离培养hPDLCs,所获细胞符合牙周膜来源细胞特性,证实为hPDLCs。 2. Asporin高表达于牙周组织以及牙周膜细胞中,定位于hPDLCs胞质中。 3.促炎性细胞因子IL-1β, TNF-a, IL-17, IL-8均能抑制hPDLCs Asporin的表达,抗炎性因子TGF-p促进hPDLCs Asporin的表达。 4.推测Asporin参与牙周炎致病与修复过程,可能通过炎性因子下调牙周膜细胞中Asporin的表达,从而抑制其促进成骨细胞胶原矿化的能力,加速牙周炎的病理发展,抑制损伤的修复。相反,抗炎因子促进Asporin的表达,抑制牙周炎致病过程,促进其修复。但具体调控机制还需进一步研究。


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