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人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-FU的建立及其生物学特性的研究

姚学清  
【摘要】: 目的:建立人大肠癌LOVO细胞多药耐药细胞株LOVO/5-FU,并探讨 其生物学特性及耐药机理。 方法:人大肠癌细胞系LOVO在体外与2.5ug/m15-氟尿嘧啶(5-FU) 作用,诱导成功LOVO/5-FU耐药细胞株,体外细胞毒性实验观察它们对 5-FU、MMC、ADM、DDP、MTX、Arac等六种药物敏感性。用噻唑蓝(MTT) 法、光镜及电镜观察两种细胞的形态及结构差异,绘制两种细胞的体外 生长曲线。电镜、DNA凝胶电泳和原位DNA末端转移酶标记法,分别检 测耐药细胞株LOVO/5-FU及敏感细胞株LOVO对5-FU诱导细胞凋亡的情 况。采用免疫组化LSAB法检测两种细胞对P26-Bcl-2表达。 结果: 一.LOVO细胞系经5-FU周期性作用诱导培养6月,获得了多药耐药 细胞系并命名为LOVO/5-FU,该细胞系对5-FU的耐药指数为16.48,对 MMC、DDP和ADM有交叉耐药性,但对MTX、Arac仍保持与LOVO细胞几 乎相同的敏感性。在脱离5-FU体外冻存10月,其耐药性可保持60%。 二.LOVO/5-FU细胞株对5FU、MMC、ADM、DDP均有耐药性。此细胞 株对5-FU的耐药程度较亲本细胞提高,与亲本细胞相比,耐药细胞株生 长慢,倍增期延长,汇合密度低,异型性明显;LOVO/5-FU细胞胞体体 积变大,贴壁生长时形态拉长,贴壁牢,细胞之间易聚集成团,细胞表 面有微绒毛。但其体外群体生长时间与亲代细胞的差异不显著。 三.免疫组化LSAB法证明,两种细胞均表达P26-Bcl-2,光镜下,LOVO 和LOVO/5-FU细胞胞浆可见深浅不一的棕黄色物质,LOVO/5-FU细胞较 LOVO细胞明显深染,用图象分析仪分别定量测定两种细胞中的棕黄色物 质的光密度值,经两样本均数比较的t检验,P<0.01,按a=0.05标准, 说明LOVO/5-FU细胞P26-Bcl-2的表达高于LOVO细胞。LOVO/5-FU细 胞可以抵抗5-FU诱导的细胞凋亡,其凋亡机理与P26-Bcl-2过度表达有 关。 四.5-FU2.5ug/ml作用LOVO细胞48h和5-FU5ug/ml作用LOVO/5-FU 细胞48h。均产生细胞皱缩,染色质浓缩,核碎裂;透射电镜显示: 2.sug/m15-FU作用LOVO 细胞48h臣出现凋亡刁体和25gg/m15-FU作用 LOVO/5-FU 48h出现核固缩;SFU 2.sus砌 作用 LOVO 细胞 48h、72h和 LOVO/5-FU细胞 72h以及 2.sug/ml、sus/ml、7.sug/ml作用 LOVO 48h 和sug/ml、7.sug/ml作用LOVO/5-FU 48h细胞mA凝胶电泳出现梯形 (ladder)凋亡带,5-FU 2.sug/ml作用 6h、12h、18h、24h,LOVO细 胞原位加A末端转移酶标记阳性率高于LOVO乃干U细胞。 结论: 一.本研究成功的建立L0V0/5干U多药耐药细胞株,其耐药性稳定,是 研究大肠癌MOR的理想模型: 二.恒定药物浓度周期作用方式是体外诱导大肠癌耐药细胞系更好的方 式; 三.LOVO乃干U细胞生物学性状改变可能与其多药耐药性紧密联系在 一起: 四.5干U诱导人大肠癌LOVO和LOVO历-FU细胞凋亡,具有明显的时 间和剂量效应; 五.在相同条件下,耐药细胞株LOVO/5-FU和敏感细胞株LOVO寸比, LOVO/5-FU细胞凋亡受到抑制,它可能是大肠癌LOVO 细胞灿R发生 机制之一,研究细胞凋亡机理对克服化疗产生的多药耐药及逆转多 药耐药具有重要的临床价值; 六.L0V0/5干 细胞可抵抗5斗U诱导的细胞凋亡,其抗凋亡的机理可 言与P26-BC12过度表达密切相关,P26-B。l-2过度表达可能是大 肠癌MDR重要机制之一。


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