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不同浓度普鲁卡因对大脑皮层锥体神经元延迟整流型K~+通道的影响

李长科  
【摘要】: 目的 本文运用膜片钳技术,采用内面向外式记录方法,研 究不同普鲁卡因浓度对皮层锥体神经元胞体上延迟整流型K~+通道 的影响,进而探讨普鲁卡因对中枢作用的分子机理。 方法 1神经元的急性分离2~5天龄的SD大鼠,雌雄不限,断 头、取脑,掀取项叶皮层并切成薄的脑片,置入去钙、镁人工脑 脊液(ACSF)中吹打后,放入含2.5%胰蛋白酶的人工脑脊液中 消化。吸取消化后的细胞悬液3~5滴,涂于经多聚赖氨酸处理 的盖玻片上,细胞贴壁后入高钾浴槽液中。 2实验分组 普鲁卡因经微量加样器加入,按其浓度分为8 个组:0(对照组)、0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L。 每组以7个不同的钳制电压,观察11个样本。 3单通道记录 采用膜片钳技术的内面向外式单通道电流, 用电极拉制器两步拉制电阻为10~12MΩ的电极,加热水平分别 为65、57,尖断直径约0.5~1μm,充灌高钾电极液。电流经膜 片钳放大器放大,探头反馈电阻10GΩ,低频滤波频率为1kHz(3 dB,4-bessel),用PCM录像机记录。 4资料分析 信号经Digidata 1200接口的数据采集系统和 6.04版Pclamp采集程序,采样频率5kHz,开关时间的忽略水平 为200μs。将原始资料输入pⅢ-300计算机,用FETCHAN分析 程序自动测量通道的电流幅度、通道开放和关闭时间,再进入 pSTAT作初步统计处理。用SPSS8.0统计软件对各浓度组做线性 中日人民解放军第一军医大学硕士学位论文 回归分析得出电导,分别以不同细胞、钳制电压或l和药物浓度为 分组变量,分析定量变量,包括电流幅度、电导以及通道开关动 力学的变化;各普鲁卡因浓度组间的电流幅度、电导以及通道开 关动力学参数的差异行方差分析。 结果 1延迟鳖流型义沤沮的确认与特性 在一定的范围内,通道 的电流幅度随去极化程度增加而增大,即随着钳制电压的变化而 变化,所得的电流幅度-膜电位关系曲线O-V曲线)呈直线。各钳 制电压与平均电流幅度的关系,反映电流幅度对电压的依赖关 系。在某一钳制电压下,电流幅度.开放时间的散点图显示开放事 件,均集中在一定的电流幅度水平,通过计算可以得出其优势电 导为52土2.4ps,也表现出明显的电压依赖性。 采用内面向外式时,在本组实验液体下,通道的翻转电位 (Rerersa Potential,EJ接近于 omV;以 140mmol的 cscl代替浴 槽液中的KCI,通道电流基本消失;但用20 mm。l的个氨基毗唆 (-AP)替代原浴液,通道电流活动则无变化。此外,TTX以及低 钙整液中的 EGTA乙二醇双氨基乙基四乙酸)阻滞了钠、钙通t, 氯离子通道难以记录到,因而确认其为延迟流型K+1道。 二普鲁卡因对延追羹流型K31jt的影响 zl对迟邀电流幅匣与电导的影响 对照组与7个普鲁卡因浓度组各自的I-V曲线基本呈直线, 此即为本实验记录单迟道;0.4mml组卜V关系线斜串最小,通 道的电导达最低o6士1.4ps卜此后随浓度的增加电导逐渐增加, ~4~ 中国人民解放军第一军医大学硕土学位论文 并在Z4mmol时,电导值达最高O0士2刀昨入 2.ZRtrjljN开放动力学的彤响 对照组开放概率为引.6%士 3.9%,当浓度增加至 0.4mmol时, 开放概率骤降至26.2%士2.0%;尔后,随药物浓度的增加开放概 率逐渐提高,最高达78%土5.9%。在电压与开放概率的关系方面, 钳制电压O巾增加,开放概率逐渐减小,此时电极下的膜片跨膜 电位 vin=-Vp,既当 Vp愈接近 VRE,vin就愈接近静息膜电位, 因而其开放概率就逐渐接近于零。 2.3对开放时间常数的彤响 对照组通道的短时程开放时间常数一。;)为75土6.329ms,当 浴槽液中加入 0.Zmmol的普鲁卡因,甚至更低浓度,\;立即降 至 5土2.402ms,且此后\;随药物浓度无明显的变化 长时程开放时间常数h。。)在加入药物后略有降低,当药物浓 度增至 0.4mmol时,。*降至 24土 3.202ms,降幅约 15 土 1.4325, 药物浓度达 0.smmol时,\。又达未加药时水平;继而在 1.6 nunol 时 T。达最高点,即 73士5.307ths;以后随药物浓度的增加\2又 程下降态势;对开放时间的影响基本与长时程开放时间常数 T。。 相对应。 又4对关闭时间与关闭时间常数的影响 通道的关闭时间常数h。)对照组为78.566土16.9761:ifS,加入 药物后关闭时间延长,普鲁卡因浓度为0.4mmol时,关闭时间达 303.727 土78.3465,以后随浓度增加关闭时间逐渐变短,浓度 为 1.6


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