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疟疾荧光定量PCR诊断技术的研究

江晓玲  
【摘要】: 疟疾是广泛流行于热带、亚热带甚至温带边缘的一种重要虫媒传 染病,对人类健康造成很大危害,其防治深受国际医学界的重视。快 速、有效的疟疾诊断方法,已成为疟疾防治问题的迫切需要;而简 便、快速定量检测疟原虫的方法,更因能准确定量检测疟原虫,不仅 在研究疟原虫的感染程度与疟疾发生、发展的关系以及抗疟治疗的监 控等方面具有深化疟疾防治研究的良好功能,同时也可为新药和疟疾 疫苗的研制和评价提供更客观、可信的量化资料。 近十年来迅猛发展起聚合酶链式反应(PCR)技术及以其为基础 的定量技术,以其快速、简便以及高灵敏度等优点,在疟疾的诊断中 受到了广泛的重视,但存在有产物的污染易致假阳性、PCR扩增后期 出现“平台效应”而难以准确定量等问题。1995年出现的一种以有探 针、可实时定量监测为特征的荧光定量PCR检测方法,因能有效克服 上述缺点,而引起了国际医学界的高度重视,在病原体检测中有取代 传统PCR的趋势。本研究的目的即是建立两种最常见的疟原虫——恶 性疟原虫和间日疟原虫的荧光定量PCR检测方法并对其进行评价,为 开发快速、准确定量检测疟原虫的荧光定量PCR检测试剂盒奠定基 础。 根据两种疟原虫SSUrRNA基因的保守序列,分别设计针对恶性 疟原虫和间日疟原虫特异的引物和探针(探针位于上、下游引物之 间),并对探针进行荧光标记。采用PCR产物克隆法分别构建恶性疟 和间R疟SSUrRNA靶片段重组质粒,用作荧光定量PCR的阳性标准对 照,分别进行荧光定量PCR扩增条件的优化和标准曲线的建立。最后 以此为基础进行样品检测,通过与常规PCR、镜检结果的比较,对恶性 疟原虫和间日疟原虫的荧光定量PCR检测方法作出评价。 结果显示,所克隆的恶性疟原虫和间日疟原虫的重组质粒,通过 酶切鉴定和对克隆基因的测序鉴定,表明克隆基因的片段大小和基因 序列与目的基因完全一致。 对荧光定量PCR进行条件忧化的结果为,Mg’”的最佳浓度为。 5刀mmol/L,退火延伸最佳温度为55℃。在此条件下,对恶性疟原虫和 间日疟原虫的阳性定量梯度模板进行扩增,得到PCR扩增的动力学曲。 线图。分析表明,不同起始浓度的模板。在反应后平台期的产物量相。 差不大,而如果将检测点定为产物大量生成初期的循环数一循环阈值。 uT值),则发现起始模板浓度的对数值与 CT值之间呈良好的直线 才关关系,十关系数分别为 0.998(P<0二001,恶性疟)和 0.996 …狈.001,间R疟),两种疟原虫的检测阈值均值为100拷贝/ul。 进行样品的荧光定量检测时,均设阳性定量标准模板对照和阴性 对照。将每份样品检测所得曲线的CT值与CT一模板浓度相关曲线相 比较,即得出定性和定量结果。对 127例疟区患者血样的定性结果显 示,恶性疟原虫镜检、常规PCR、荧光定量PCR检出的阳性率分别为 33.l0、39.4o,40.2O:问H疟原虫镜检、常规Pm、荧光定量叮R阳 性率分别为36二%、忙.5%和忙厂%。统计学分析表明三种方法两两之 间有一致性h.001),而荧光定量PCR与镜检法之间存在差别 …狈.01 人与常规PCR法无显著性差异巾川.05)。对镜检阳性血 样的定量检测结果表明,定量检测的拷贝数和镜检感染率之间具有直 线相 关关系,相关系数分另 为0.961(p(0.001,恶性疟)和 0.95 9(狈.001,间日疟\另外,荧光定量mR还显示出较高的灵敏度 和特异度。恶性疟检测的灵敏度为 IXIO’%(原虫感染率,每 100个红 3 细胞中的原虫数),间R疟为1.26XIO’%(原虫感染率),此浓度下 的血样DNA模板用荧光定量PCR扩增仍可出现典型‘S”形曲线,而镜 检法在原虫率为4X10-’%时己很难得出阳性结果,而对非疟区m份正 常人血样的检测结果均为阴性。上述结果显示,荧光定量PCR具有较 高的灵敏度和特异度,并在一定程度上优于镜检法和常规PCR法。 研究表明,我们已在国内外首次建立了恶性疟原虫和间日疟原虫 荧光定量PCR检测法,小样木血样的检测反映了此法的准确性和优越 性。为研制疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒奠定了基础,也为更深入 的疟疾防治研究提供了一条可行途径。


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