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恶性胶质瘤相关新基因的筛选、克隆及其特性研究

杨志林  
【摘要】: 背 景: 胶质细胞瘤是颅内最多见的一类肿瘤,也是首位颅内肿瘤相关的死亡原 因。尽管在其诊治方面已取得很大进展,但治疗效果改善不大。所以仍有实际 需要去寻找胶质瘤的标志物和新的治疗靶点。虽然最近人们发现许多生物因素 参与了胶质瘤的发生发展过程,象凋亡因子,细胞粘附因子,细胞外基质,血 管生成因子,信号转导通路等,但还没有一种作为胶质瘤的治疗靶点是有效的。 所以新的胶质瘤特异基因的筛选对新的药物设计、疫苗研制或新治疗途径的设 计是有益的。 研究目的: 1.用基因芯片筛选胶质瘤相关的新基因。 2.用Northern Blot验证芯片筛选新基因的表达水平并确定其组织表达特异 性和mRNA长度。 3.扩增克隆具有胶质瘤特异性新基因的全长并用生物信息学研究其可能特 性和功能。 4.新基因进行原核表达并纯化蛋白。制备多克隆抗体并用于组织特异性表 达的研究。 方法: 1.临床胶质瘤及其瘤周组织取下后立即清洗冻存于液氮中,组织由病检证 实。其中6例为胶质母细胞瘤,4例为间变形胶质瘤,3例为星形细胞瘤。 2.芯片杂交及分析: 14000个基因的膜芯片由上海细胞研究所Max-Plank客座实验室制作。 mRNA提取按Qiagen公司的mRNA提取试剂盒操作。cDNA探针以~(33)P-dATP 为标记,用逆转录法标记探针。杂交炉内杂交,Om莫。磷屏显影,扫描分析。 扫描图像进行一对一对比。 3.N。Ithem BIOt分析: 提取的InRNA电泳后转移到尼龙膜上。山筛选到的新基因的cDNA克隆 切下片段、用中标记标针,同芯片实验一样杂交洗膜。图像扫描进电脑进行 密度及污点大小分析。 4.胶质瘤特异基因的全长克隆: 恶性胶质瘤特异表达的新基因按克隆号命名为HTB,用CIOnteCh公司的 SMAK RACE试齐盒扩增。光根扼己知部分片段设计两条用于 3’及 5’扩 增的基因特异性引物。按说明书扩增后用重复片段中的酶切位点酶切片段后克 陇pTAdy 载体进行测序。 5.序列的生物信息学分析主要在网上的NCHI,PROSITh,SWISS-PROT, EBI,PDB、AllAll t库中进行。 6.克隆基因的原核表达和蛋白纯化。 基因的蛋白编码区经PCR扩增后,亚克隆进PGEX4TIW并在大 肠杆菌中表达。表达的融合蛋白(命名为GSTHTB)亘接电泳纯化。 7 e蛋白抗体策备及 Wt Blot分析。 纯上的蛋白免疫小鼠,获得多克隆抗体血清。汕清作一抗。辄鼠炒 作二抗,HRT作显色SM行 Western Blot分析。 结 果: 1.丑 耕本 临床胶质瘤样本均病理证实,所提总RNA在凝胶电泳时可见明显三条亮 带。组织免疫化学挪阿见GFAP,Vimentm及S。100蛋白均染色阳性。 2.CDNA芯片及杂交 胶质母细胞瘤与正常脑组织相比,94个3倍以上差异表达基因被筛选,2 倍以上差异表达基因有 298个。其中 56个基因 3倍上调,175个基因二倍上调, 38个基因3倍下调,123个基因2 {i下调,而11级呈形细胞瘤相对于正常脑组 织及咬质母细胞瘤也有刀个基因及38个基因3倍以上差异表达。 3.NOIthm blot 选择6个胶质瘤上调新基因进行NoITIsenl blot分析,其中4&8%till了芯片 杂交结果。一条基因命名为Hi的基因在组织中的表达量明显与胶质瘤的恶 性阻相关。铆L啊片段大小约800hp. 4.Hi荫Uflk的克隧0分析 glf--x--克隆测序,80fop的基因序列被扩增和克隆。序列d可见,它包 含一个3’;Zbp的ORF,翻译113 W基酸的蛋白,蛋白肝黝12.38KD, 等电点4.9。可能是位于细胞浆的可溶性蛋白。具有Casel!1 ldnase 11(CKZ) 磷酸化位点和G蛋白偶联受g印。BLAST p表明,其最大同源基因U 是今年4月登录到GEN’EBANK的-条从黑0素瑚中克隆的一条基因,同源性 70O/,最大同源蛋白也是这条基因所编码的蛋白,同源性4op,功能尚不清。 5.蛋白表达和岭屯比 基因被亚克隆进原核表达蹦pGEX4T-IAI于原核秘。与猕中的GST 融合表达出一个大’J喧勺38KD的融合蛋臼,并采用制备电泳法对表达产物进行 纯化。 6.多抗$幡和 Wt blot分析 免疫小鼠帘临韵多抗对工程菌表达的 38.38KD GST4flB蛋白具有特异识 别能力,也8钩拐怫扳凋细胞瘤中一个12.38KD的蛋白,其蛋白分子量与理论 Hi M’J’wt。 结论 利川基冈芯片技榔$选出了 条 留特异的新基用,刹U ILACE技术获得 基因的全长序列,应用生物信息学对其特性和功aed行了初步研究,并在大肠杆菌 小进行了 鉴定,研究表明它有可sha为


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