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一氧化氮合酶抑制剂对关节软骨修复组织的影响

孙炜  
【摘要】: 研究背景 关节软骨的损伤和退变是临床最常见的疾病之一。而关节软骨的自 我修复作用非常有限。因此,怎样促进关节软骨修复重建一直是骨科工 作者不断追求,渴望解决的难题。然而,无论是自体或异体软骨移植、 软骨细胞移植,或者三维立体细胞培养及组织工程技术的利用,都仅能 在早期生成透明和类透明软骨组织,且随后不可避免会发生退变。而这 些再生的软骨组织,无论是其结构、生物化学或者生物力学特性都与正 常透明软骨不同。因此怎样提高再生软骨质量和防止其发生退变就成为 急需解决的问题。同时,系列研究证实诱导型一氧化氮合酶抑制剂的应 用有助于炎性软骨代谢的恢复,而目前研究均着重于寻找使关节软骨缺 损修复的方法,很少去研究如何提高修复组织的质量以及如何防止发生 退变,更少探讨其原因。既然NO对软骨形成和基质合成有抑制作用, 能促进软骨的退变,那么进一步弄清NO作用于再生软骨退变过程的机 理,并且采用iNOS抑制剂等干涉手段,可望使修复组织不发生退变或 减漫退变,提高修复组织的质量,维护关节的功能。 目的和意义 (1)探讨各种一氧化氮合酶抑制剂对软骨细胞和软骨生物学特性的 影响,为动物试验提供理论基础;(2)建立关节软骨缺损模型,探讨一 氧化氮合酶抑制剂SMT对再生软骨的影响,为临床应用提供理论基础; (3)探讨一氧化氮合酶抑制剂SMT对骨性关节炎的潜在治疗意义。 材料与方法 门)从成年新西兰大白兔膝关节无菌分离软骨细胞和软骨片,通过 MTT法检测 ILj 和 LPS以及 NOS抑制剂对软骨细胞毒性反应,确定 ILq和 LPS对软骨细胞合适的作用浓度。然后,以合适浓度 ILl 十LPS, IL-16 + LPS+SMT,IL-16 +LPS+L-NIL,IL-10+LPS+L-NMA分别作 用于软骨细胞和软骨,采用重氮化反应法测定NO释放量,NOS活性; 3咕掺入法检测蛋白多糖合成;原位杂交检测软骨细胞 iNOSmRNA表达; RT-PCR检测软骨组织 eOS和 MMPgmRNA的表达以评价不同 NOS抑 制剂对软骨细胞和软骨代谢的影响。 (2)ZI只雄性新西兰大白兔随机均分为正常组(不使用任何干预 药物人对照组(皮下注射生理盐水后给予膝关节内注射 IL刁 卜g·ml”‘ 和 LPS 20ug·ml一各 0.lml);SMT组(将 SMT sing·kgJ,l次·12h1经皮 下注射,持续 24小时后,膝关节内注射相同浓度 IL1时0 LPS混合液人 8小时后检测关节软骨、滑膜和滑液NO释放量和NOS活性,48小时后 测定软骨蛋白多糖合成和oOSInRNA表达。初步确定NOS抑制剂SMT 对炎性因子刺激的关节软骨代谢的影响,以及给药的浓度和方式。通过 聚丙烯酷胺凝胶电泳鉴定AsMPZ以及用肌袋埋植法检测其成骨活性。 (3)将66只雄性新西兰兔,随机均分为正常对照组(双侧膝关节 软骨缺损不充填任何物质及用药物干涉);BMP组(缺损应用BMP纤维 蛋白凝胶复合物充填);SMT组(术前给予sing上g-’·12h”’皮下注射SMT, 缺损应用BMP纤维蛋白凝胶复合物充填)。根据观察时间不同,治疗时 间为8周、16周和1年。按观察时间处死动物,分别作组织形态学、组 织化学、原位杂交和RTPCR观察SMT对修复组织质量的影响;3咕掺 入检测修复组织蛋白多糖合成。 (4)无菌获取OA患者的关节软骨和滑膜,分为3组。对照组不 加药物干预;L一NIL组力入 1。l,L”’L一NIL干预;SW组力入 1。OI·L-‘ SMT干预。孵育刀小时后,通过检测硝酸盐和亚硝酸盐的含量来观察 软骨NO的释放量以及WOS的活性;原位杂交检测软骨iNOSmRNA和 MMPglnRNA的表达。孵育 10天后,化学比色法观察软骨蛋臼多糖含量 和胶原释放量的变化。 .4. 结果分析 门)*TI’法显示,软骨细胞分别与2*g·m*uS走lllg、Ml1卜lp 以及0《 浓度的NOS抑制剂共同培养72小时,未造成明显的毒 性反应。…gthl”‘外源性ILl和0上屹·m1“‘L陀可明显促进培养软骨细 胞和软骨 NO释放,诱导 iNOSmANA表达,增加 NOS活性以及抑制软 骨基质蛋白多糖的合成。当 LPS浓度为 5-20pg·ml”时 NO释放量最为显 著:而加入100《000叩**OS抑制剂均能剂量依赖性抑制炎性因子诱 发的软骨细胞和软骨NO释放和NOS活性的增加;lmmol浓度的NOS 抑制剂可显著逆转软骨细胞和软骨蛋白多糖合成抑制以及抑制oOS和 MMPg基因的表达。 Q)动物实验显示lpg·ml-‘1卜lp和10叱·m卜**S关节内注射后8 小时,能显著增加在体软骨、滑膜和滑液中硝酸盐和亚硝酸盐的含量, 增高NOS活性,以软骨对刺激因子的反应最敏感。注射后48小时,软 骨 3咕 摄入量被显著抑制,yOSmRNA 表达明显上调,而 sing·kg-‘·12h-‘SMT皮下注射能明显逆转其对软骨蛋白多糖合成的抑制, 下调ffoOSlllJLrvA的表达。聚丙烯酞胺凝胶电泳显示thBMPZ获得表达; 成骨活性表明thBMPZ植入1周后,出现软骨组织;2周后,新骨组织形 成;4周后,新骨成熟。 (3)软骨缺损动物模型显示;术后8周、16周和1年后,形态


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