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放线菌来源的乙酰胆碱脂酶抑制剂的筛选

金宏  
【摘要】: 阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease,简称AD)(又称老年性 痴呆)是一种最常见的中枢神经进行性的退行疾病,分为家族性和散 发性两种,百分之九十以上为散发性的。临床特征是记忆力、智力、 认知能力及行动能力丧失。已成为老年人第四位致死的原因。全球现 有AD患者约二千余万人,随着老龄化人口不断增加,AD患者的护理 和医疗费用大幅增加,AD已成为多学科广泛关注的研究课题,试图找 到彻底治疗AD的方法。 AD的发生机理目前尚不十分清楚,根据AD的临床特征、病理变 化及分子生物学研究进展认为,AD的发生是包括与年龄相关的多种因 素相互作用的结果。归纳起来主要有以下两种学说:1.胆碱能神经损 伤学说 乙酰胆碱与人类的注意力、认知功能及行为能力有着密切的 关系;AD的主要病变特征是细胞外β-淀粉样蛋白的形成及细胞内神 经纤维缠结的形成,从而导致神经元丧失、突触数量减少,胆碱能神 经传递作用减弱,胆碱能损伤学说的研究进展认为,β-淀粉样变物质 的形成受乙酰胆碱的调控。脑神经中的Ach水平降低而使Ach神 经传导损伤与AD病人的认知能力丧失及行动能力减弱等痴呆症状有 关,这些新的研究进展,为发展治疗AD疾病的拟胆碱能药物提供了强 有力的证据;2.遗传学说 目前发现,至少有4种基因的突变与家族性 AD的发生相关,包括APP、PS1、PS2及APOE等。这四种基因的病变 与家族性AD发病有一定关系。亦主要是影响β-淀粉样变物质的形成 及神经纤维缠结的形成,但是其究竟如何引起这些病变,其作用机制 未明,临床上还未有针对这些靶点的有效治疗药物。 在农业领域,有机磷和氨基甲酸酯类是开发最早,应用时间最长、 种类最多的杀虫剂,其作用机理都是对乙酰胆碱酯酶的抑制。但这些 化学合成的杀虫剂对人类具有高毒,而且由于其活性基团相似或相同, 使用时问较长后,很多昆虫易对其产生抗药性。而且,随着高科技农 业的发展及环境保护的要求,高效低毒、低残留的生化农药的需求越 来越高。迫切需要厂发新型生物农药,而微生物来源的次级代谢产物 作为杀虫剂,具有高效低毒、低残留的特点,由于这类化合物来自自 然界,土壤中存在着一定的微生物可以分解这些产物,克服了人工合 成的化学农药不易分解、易产生环境污染的缺陷。不易对环境造成残 留残毒影响。由此可见,开发研制来自微生物的乙酚胆碱酯酶抑制剂, 不但在医药领域有重大的应用前景,而且,在农业领域可逐步取代高 毒的有机磷和氨基甲酸酯类的杀虫剂,对保护人、畜健康和保护杜会 生态环境具有重大意义,有着广阔的应用前景和商业价值。是一类前 景广阔,值得大力开发和应用的新型生物农药。 从放线菌发酵产物中还未有筛选出此类化合物的报道。因而从其 次级代谢产物中发现新型乙酚胆碱酯酶抑制剂的可能性较大。 根据胆碱酯酶对乙酚胆碱和丁酚胆碱的选择性水解作用可分为 乙酚胆碱酯酶和丁酚胆碱酯酶。本实验运用改良的ELLMEN氏反应,建 立针对乙酚胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选方法。从2000余株放线菌中 筛选出35株阳性菌株(对乙酞胆碱酯酶的抑制率大于50%),其中数 株对乙酚胆碱酯酶具有选择性的抑制作用(对乙酚胆碱酯酶的抑制率 大于丁酚胆碱酯酶)。从中挑选11株阳性菌株进行固体发酵,不改变 其发酵条件,目的是进行活性的重现性发酵。结果仅有一株编号为 106-13的为阳性。进行液体发酵结果与固体发酵结果相同,亦仅有编 号为 106习 3的为阳性。对阳性菌株的固体发酵的代谢产物的活性与发 酵时间的关系进行的研究表明,阳性菌株代谢产物的活性在29”C生化 培养箱培养S* 天其活性较高。本实验运用多种不同碳源和氮源的培 养基对阳性菌株的液体发酵条件进行了研究。发现阳性菌株的较佳生 长条件,尤其对其代谢产物的活性与发酵时间的关系进行了较详细的 研究。对培养基的优化进行的研究表明,(NH4)2504会抑制活性物质 的产生。 .4 对发酵产物进行了系统的分离与纯化处理。采用固体发酵方法, 经乙醇、乙酸乙酯等处理后,取得粗样品80克。经硅胶柱层析及超滤 后,分离掉较多的杂质。并对样品进行了紫外分光光度计、高效液相 色谱和制备色谱等分析。经分于量低于500的微孔滤膜超滤,检测发 现活性成份的分于量低于500。己作的研究结果表明,目标菌株发酵 物中的活性成份具有很好的脂溶性,且因为其分子量小,容易透过血 脑屏障,作用于中枢胆碱能神经系统。本实验还须对活性物质进行进 一步的纯化,取得活性物质的单体,进行结构与活性及其选择性抑制 作用的研究,通过对其进行结构改造与修饰,提高其活性和对乙酚胆 碱酯酶的选择性抑制作用。


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