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热适应大鼠下丘脑差异表达基因的分离,鉴定和序列分析

王光海  
【摘要】: 人类在特殊恶劣环境下的适应和耐受能力是基础与临床均非常关注 的课题。它是决定人类与环境交互作用中能否适应环境而维持生存的关 键。南方高温高湿气候属特殊环境研究的对象之一。部队作为一特殊的 群体,要求在高温高湿环境的野战条件下维持战斗力和生存能力。解决 这些问题的关键在于运用适当的方法与措施,使机体迅速获得和维持热 适应能力。然而,目前仅对热适应现象的事实及其生理学机制较为肯定, 由于受方法学的限制对其分子机制的本质尚不清楚,更缺乏与体温调节 关系密切的下丘脑组织在热适应过程中存在基因差异表达的报道。因 此,尚无更有效方法提高机体热适应能力和评价热适应水平。 目的:本研究瞄准热适应分子机制这一难点问题,试图运用改良的 差异显示PCR技术,探讨热适应大鼠下丘脑神经元基因的差异表达, 力求在基因水平上阐明热适应的本质问题。 方法:本实验在以往研究的基础上对差异显示技术进行了改良。具 体方法是用单铆钉引物替代双铆钉引物,延长引物长度至20个碱基以 上,以提高PCR反应的严谨性及PCR反应中dNTP的浓度,并使用严 格的重复实验的方法,最终得以确定差异显示基因片段。 结果:经过提取总RNA,反转录PCR 测序电泳和放射自显影等 一系列步骤,实验发现了一条热适应组含量明显高于对照组的差异显示 片段,经斑点杂交鉴定为阳性差异表达基因片段。克隆这条基因片段后, 进行测序和序列分析。测序结果为一条长 164hp的 DNA序列。递交 gCnebank后获得登记号BG642391。经相似性分析确定了该差异表达基 因的同源序列是哺乳动物细胞色素C氧化酶Vile亚基的编码基因。 结合文献报道,细胞色素C氧化酶是线粒体有氧呼吸链的终端酶, 负责催化氧化还原反应和能量转化。它是一种结构和功能都较为保守的 酶复合体,哺乳动物细胞细胞色素C氧化酶Vile亚基与酵母细胞中此 酶的Vlll亚基具有同源性,而后者具有提高全酶催化活性的作用,因此 推测哺乳动物细胞色素C氧化酶Vile亚基也具有类似作用,即它的表 达增高促进热适应大鼠下丘脑组织有氧呼吸和能量转化。对几种哺乳动 物的细胞色素C氧化酶VllC亚基的研究发现,它的分布缺乏组织细胞 特异性,这说明它的表达增加是热适应动物的全身性反应,进一步说明 细胞有氧呼吸水平提高对动物保持热适应能力具有重要作用。 结论:改良了差异显示PCR技术,发现了热适应过程中与体温调 节关系密切的下丘脑组织一条高表达的基因片段,确定了其同源序列是 哺乳动物细胞色素C氧化酶Vile亚基的编码基因,解决了热适应过程 中部分基因差异表达的分子机制问题。


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