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重组腺伴随病毒载体表达双亚基蛋白质的研究

郝晓萌  
【摘要】: 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导 入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病 目的。目的基因、基因转移和基因表达是基因治疗的三大要素,基因治 疗的成功,需要三者完美的结合。很多治疗性蛋白质由多个亚基组成, 体内如何表达这类蛋白质是基因治疗中的一个难题。通常采用的方法有 两种,一种是用两个启动子分别控制两个亚基基因的表达,另一种是将 两个亚基的基因用内部核糖体结合位点(IRES)连接起来,由一个启动 子控制。它们各自均存在着一定的缺陷,有待于进一步完善。 2型腺伴随病毒(adeno-associated virus type 2,AAV-2)是一种微小病 毒科的缺陷型病毒,具有对人体不致病、可感染处于分裂期和非分裂期 的细胞和能介导外源基因长期稳定表达等优点。经过改造得到的重组腺 伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体是一种比较理 想的基因转移载体,有望用于多种人类疾病的基因治疗。本研究利用多 个rAAV载体可以同时感染一个宿主细胞的特点,分别以人白细胞介素 12(human interleukin-12,hIL-12)和流行性出血热(epidemic hemorrhagic fever,EFH,又名肾综合症出血热,hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)病毒核蛋白抗体为模型,探讨了用两个AAV载体分别表达亚基 的方法表达完整蛋白质的可行性。 将hIL-12的p35亚基和p40亚基分别克隆到AAV载体质粒-pSNAV 中,构建成pSNAV-IL12-p35和pSNAV-IL12-p40质粒,并用脂质体分别 将质粒转染BHK-21细胞,G418选择培养后形成新霉素抗性的rAAV载 体细胞株,经扩增、染毒、纯化后,分别获得rAAV-IL12-p35和 rAAV-InlZ中40,在体外将两种rAAV共同感染BHK毛 细胞,48 ,J’时后 收集细胞培养上清进行兔疫学和生物学活性检测,经ELISA检测,产生 的 hILl p70的含量为 10.185pg/ml;采用促进 IFN-m分泌实验,证明了 通过共表达的方式可以在体外产生具有活性的 址L12。实验获得的 r删-InlZ十35和 r洲-InlZ巾40有可能通过局部注射的方式对恶性肿 瘤起治疗作用。 采用类似的方法,将EFH病毒核蛋白抗体的轻链、重链分别克隆到 的 AAV载体中,构建了 pSN”-ANTM和 pSN卅-ANTIn质粒,进行 G4选择培养、扩增、染毒、纯化后,将两种重组的 rAAV体外共同感 染 BHK.ZI细胞,48小时后收集细胞培养上清进行免疫荧光检测,证实 可以在体外产生完整的EFH病毒核蛋白抗体。 本研究采用的双亚基分别表达的方法模拟了双亚基组成蛋白质的自 然表达方式。由于将双亚基分别构建在不同的表达载体上,这就避免了 亚基之间在表达上的相互干扰;亦可通过调整两种rAAV的比例,使两 个亚基在细胞内的表达比例更符合于自然状态。因此,与一个载体表达 两个亚基的方式相比具有一定的优越性。 本研究采用两个 AAV载体分别表达亚单位的方法,表达 hIL-12和 EFH病毒核蛋白抗体获得成功,进一步证实了双亚基分别表达形成具有 完整功能活性蛋白质的可行性。本研究首次建立的 hIL-12的表达方怯具 有潜在的临床应用价值;利用轻、重链分别表达的方式表达抗体为国内 外首次报道,为抗体的基因治疗应用于临床提供了实验基础。


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