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胃癌耐药细胞的生物学特性及凋亡相关分子的表达

王少东  
【摘要】: 肿瘤耐药的研究一直是肿瘤研究的热点问题,如何让这些不可死亡的肿瘤细胞发生凋亡而最终达到治愈肿瘤的目的是研究肿瘤耐药的学者们一贯的思路。本研究对耐药细胞和药敏细胞的生物学特性和凋亡的关键酶caspase-3及其他凋亡相关因子进行了一系列的对比研究,目的是探讨肿瘤耐药细胞中caspase-3及其他凋亡相关因子的表达和活性,以期对肿瘤耐药的逆转有新的突破,为进一步研究肿瘤耐药的逆转奠定基础。 一、耐药细胞与药敏细胞有着迥然相异的生物学行为,表现在它的细胞内药物的减少,细胞解毒功能的增强和DNA分裂、断裂的减少,等等。为了进一步确定我们的建立的耐药细胞株的生物学特性,我们用MTT法进行了细胞存活率的试验,用荧光倒置显微镜观察了细胞内药物的蓄积,用免疫组化的方法观察了p-gp,CD44和EGFR的表达。结果表明SGC7901/V08具有多药耐药性,对长春新碱和阿霉素有较高的耐药指数,在荧光显微镜下观察发现其细胞内药物浓度较低,在其细胞膜上有p-GP的表达和EGFR的表达,这可能与SGC7901/V08的耐药性有关。 二、caspase-3在耐药细胞及药敏细胞中的基因序列、基因表达、蛋白表达及其活性的研究。我们用RT-PCR的方法克隆了耐药细胞和药敏细胞中的caspase-3,研究结果表明在肿瘤耐药细胞和药敏细胞中的caspase-3的基因序列没有差别且与文献报道的一致。caspase-3 mRNA在两种细胞中的表达在无药物作用时mRNA的表达量无显著性差异,在耐药细胞用高剂量药物作用较长时间、和药敏细胞用较低剂量的药物作用较短时间时,caspase-3 mRNA的表达无显著性差异。用western-blot的方法对两种细胞中的caspase-3表达的水平进行了研究,结果显示caspase-3蛋白表达的水平在无药物作用时两种细胞的表达量相同,耐药 细胞在高剂量药物作用较长时间后出现活性蛋白的片断,药敏细胞在较 低药物作用较短的时间(6h)即出现活性片断。 三、阿霉素诱导的凋亡细胞c-fos,Bax和Be12的表达。用DNA ladder 实验对细胞的凋亡进行了研究。我们的试验表明较低剂量的阿霉素可诱 导药敏细胞出现凋亡,而较高剂量的阿霉素也可诱导耐药细胞出现凋亡, 在出现凋亡的同时,caspase亿的活性表达,而抑制了caspase六的活性 后,出现凋亡的延迟;据此,我们推测阿霉素所诱导的这两种细胞的凋 亡与caspase-3的活性有关;在出现凋亡的同时,耐药细胞表现为be12 的表达上调,bax的表达上调,c-fos的表达无变化;而药敏细胞则出现 be12的表达量下降,bax的表达量上调,c-fos的表达量下降。由此我 们可以推测在耐药细胞和药敏细胞中凋亡相关因子的表达并不同步,可 能有多种因素对其进行调节。 本文结果提示SGC7901八CR08这一耐药细胞株其生物学活性与其亲 本细胞具有显著的差别,表现在细胞内药物浓度的降低和细胞膜表面 p飞p,EGFR和CD44的表达差异;同时实验提示耐药细胞同药敏细胞一样可 以发生凋亡,其发生凋亡的途径在caspase-3的水平并无差别,这一发现 的意义在于caspase-3完全可以作为一个靶目标用于耐药细胞的逆转。与 凋亡相关的基因Be12,bax,c-fos的表达在细胞中形成了一个复杂的调 控网络,它们的表达和细胞耐药的关系可能受到多种因素的影响。


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