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氧化应激导致多巴胺能细胞死亡的机制研究

傅求真  
【摘要】: 帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)的病理特征是黑质的多巴胺能神经元的减少导致多巴胺的产生减少。虽然PD的诊断标准已明确,但其发病机理仍不十分清楚,尤其多巴胺能神经元死亡的机理不清楚,目前环境因素在PD发病中的重要性越来越受到重视,MPP~+是MPTP的活性代谢产物,属环境毒素之一,是线粒体复合物Ⅰ的抑制剂,其毒性作用有活性氧(ROS)的参与。多巴胺(DA)是脑内天然的神经递质,但易自我氧化产生神经毒素6-OHDA和神经黑素,因此是一种强氧化剂。而H_2O_2本身是ROS中的一成分,因此上述物质均有可能产生氧化应激,可用其来产生细胞内氧化应激的模型。α-突触核蛋白(α-synuclein)是synuclein家族的一员,其与PD发病的意义逐渐受到重视,成为PD发病机制研究的热点之一,但研究结果不一致,结论不一致,本实验应用不同的毒素产生的氧化应激模型,观察不同的时间点的α-synuclein表达变化,以期了解在氧化应激条件下α-synuclein在其中所起的作用。 多巴胺能神经元的死亡是凋亡还是坏死目前的研究结果不一,有许多的研究说明在氧化应激的条件下,细胞的死亡是凋亡,而部分尸检结果不支持凋亡的学说,本实验拟从蛋白表达及生化学方面观察氧化应激后细胞有无凋亡的发生。 第一部分 多巴胺能细胞的氧化应激损伤模型的建立 MPP~+及多巴胺(DA)是一类与PD有关的神经毒素,H_2O_2本身是属于ROS的成分,因此可用来产生多巴胺能细胞内氧化应激的细胞模型。我们应用大鼠胚胎中脑细胞及小鼠神经母细胞瘤细胞系N18TG2融合而成的多巴胺能的神经母细胞瘤系MES23.5,作为研究对象,外加Mpp~+:100~800μM,H_2O_2:200~800μM,DA:50~800μM,分别培养 48~72小时。以MTT方法观察细胞的存活率。结果可见,低浓度的MPP ”及DA对细胞的存活率的影响不明显,甚至可以出现先降后升,而较高 浓度(均为200pM)时,细胞存活率明显减少,呈时间和剂量依赖,这 种现象说明低浓度的DA及MPP”即使长期作用,也不会对细胞产生明显 的毒性作用,一旦超过某一浓度,即达到某一阈值,超过细胞的代偿及 清除机制,细胞就产生不可逆的变化,死亡细胞数大大增加。所用浓度 内的HZOZ则没有这种阈值效应,对细胞的毒性作用仍呈典型的剂量依赖 及时间依赖关系。以上结果表明,MPP\HZO)及DA可对多巴胺能的 MES23.5细胞产生毒性作用,在一定的浓度范围内其毒性作用呈剂量和 时问依赖。在此基础上,我们选择MPPt00pM、DA150卜M及H2O2200pM 的浓度,作为下一步研究所用的毒素浓度。 第二部分毒素作用对细胞的氧化应激指标的影响 外加毒素分别作用 6小时、12小时、24小时及 48小时,以比色法 检测细胞内OH-自山基、超氧化物歧化酶(SOD),以荧光探针DCFHZ 一DA进行细胞内ROS的测定,以llllodaminel23为探针进行线粒体膜 电位(A W。)测定,结果可见,三种毒素作用 6小时后,OH-自山基开 始增加,此后随时间延长,增加更明显,48小时时为最高;毒素作用至 24小时,细胞的SOD无变化,48小时时,SOD的活力才开始下降;ROS 在 6小时己有轻度上升,随时间延长而增加,A WM在 6小时时开始下 降,与ROS一致,下降程度与时间成正比。我们的结果表明,MPP”、 HZOZ、DA均可产生细胞的氧化应激,并且呈时间依赖,而氧化应激损 伤对细胞的防御机制的损害则发生于48小时左右。 第三部分 氧化应激对细胞内a-突触核蛋白表达的影响 a-突触核蛋白(a亿Wclein)在帕金森病(PD)发病中的意义逐渐 受到重视,但其作用机理目前仍不十分清楚,有大量研究发现a七Wclein 蛋白与氧化应激、环境毒素的关系,但结果往往不十分一致,甚至有互 相矛盾的观点,我们的研究目的在于利用我们己建立的环境毒素诱导的 氧化应激的多巴胺细胞模型,观察在氧化应激条件下,细胞内的 a七卿clein蛋白的表达变化,以期了解环境毒素、氧化应激、a七Wclein — —4 一 蛋白间的相互关系。本实验以 Wetem hi。t方法及免疫荧光双标记方法检 测在毒素作用诱导的氧化应激情况下,细胞内a—s则clein表达的变化, 及。一s仰clein在多巴胺能细胞内的分布变化。实验发现各种毒素所造 成的氧化应激模型中,a《 的表达均有不同程度的增加,应用该 室自制的抗a亿则clein单抗细胞上清作为一抗而标记的a—s仰clein可 见胞浆及核内的染色,且以核内染色更深,HZOZ处理的细胞虽染色强度 无明显变化,但分布明显与其它组不同,即主要分布于胞浆,可见明显 的核内较多的颗粒样a6Wlein深染而TH阴性的物质,似有a一 p lein蛋白在核内形成聚集的现象,我们的结果表明,即使在未转染 a6仰clein基因的细胞内,a仑 也可因氧化应激而表达增加,这 种增加与细胞内自由基的增加、ROS的增加在时间上比较一致,因此, 可以推测,这种未转染a亿卿clein基因的多巴胺能细胞的a—s伽lein 的蛋白水平的增加,是氧化应激的结果,氧化应激的条件下a—s卿lein 在


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