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逆转录病毒介导hBMP-7基因转染兔骨髓基质干细胞体内外成骨实验研究

金丹  
【摘要】: 目的 (1)构建人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)逆转录病毒载体并制备重组病毒液,检测经逆转录病毒介导hBMP基因转染的兔骨髓基质干细胞(BMSc)中外源hBMP-7 mRNA和蛋白的表达。(2)探讨hBMP-7基因转染对BMSc增殖和向成骨细胞分化的调节作用。(3)对重组病毒液和经基因转染的BMSc与左旋聚丙交酯(Poly-L-lactide,PLLA)生物材料复合后修复兔桡骨1.5cm缺损的能力进行评价,从而探讨基因转移技术在骨组织工程中应用的可行性,并建立利用经hBMP基因转染的BMSc构建组织工程化骨组织的方法。 方法 (1)采用粘-粘端连接法构建hBMP-7逆转录病毒载体(PLNCX_2-hBMP_7),利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,经G418筛选后,制备含hBMP-7目的基因的重组逆转录病毒液,病毒液感染兔骨髓基质干细胞,使用原位杂交、RT-PCR以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。(2)采用MTT法、流式细胞仪对比分析经转染与未经转染BMSc的增殖情况,NPP法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)合成情况,~3H脯氨酸掺入方法检测胶原合成情况,放射免疫方法测定细胞骨钙素(BGP)、层粘连蛋白合成情况。(3)制备新西兰大白兔桡骨1.5cm缺损实验模型,病毒液修复实验分为4组:PLNCX_2-BMP_7+PLLA修复组:PLNCX_2+PLLA修复组;单纯PLLA生物材料修复组;空白组,未加任何填充材料,于术后采用大体观察、X线观察、组织学观察方法对骨缺损修复情况进行对比检测。(4)将制备的病毒液转染BMSc,利用经转染的BMSc修复兔桡骨1.5cm骨缺损。修复实验也分为4组:经转染细胞+PLLA修复组;未经转染细胞+PLLA修复组;单纯PLLA生物材料修复组;空白组,未加任何填充材料。采用大体观察、X线观察、组织学观察、免疫组织化学等方法对骨缺损修复情况进行对比检测。 结果 (1)构建的hBMP-7逆转录病毒载体中外源基因方向、序列均正确、无碱基缺失及突变现象。原位杂交、RT-PCR以及免疫组织化学 检测显示经I,TreunXZ-BMP病毒液感染的BMS。中有较强的阳性结果出 现,而PLNCX。空载体转染的BMS。以及未转染的BMSC中极少见阳性表达 结果。G)经 PLNCXZoMP病毒介导的基因转染的兔 BMSC增殖能力无 明显改变,同时其合成胶原、ALP、BGP、层粘连蛋白的能力能够得到显 著提高,与PLNCXZ病毒液转染、未经转染的BMS。相比有显著性差异。 D)PLNCXZEMP重组病毒液与 PLLA生物材料复合修复组可见在缺 损处有骨性连接形成,组织学观察见有大量新生骨组织形成,而PLNCX。 病毒液+PLLA修复组、单纯材料修复组和未修复组均未见骨性连接形 成,仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织。(4)大体观察、X线、组 织学检测分析结果初步证实经转染的BMSc修复骨缺损的成骨速度和成 骨量均优于未转染BMSc修复组,单纯PLLA生物材料修复组和空白组 中均未见骨缺损得到修复。 结 论(1)采用逆转录病毒介导的方法可以将 hBMP.7转染至 BMSC中,并有外源hBMP7的表达。*)PLNCX。HMP7基因转染能够 促进体外培养的BMS。向成骨细胞转化,并对其增殖能力没有显著影响。 3)采用 PLNCXZEMP重组病毒液与生物材料复合的方法能够修复 兔侥骨 1.scm缺损。(4)PLNCX。-BMP基因转染能够提高 BMSc形成 组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力。(5)采用基因转染的方法能够 提高BMS。体内外成骨能力,可用于以BMSC为种子细胞的组织工程化 骨组织的构建和进一步应用。


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