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大鼠热适应相关基因消减文库的构建和差异表达基因的分离、鉴定及序列分析

肖军  
【摘要】: 人体在高温环境下适应和耐受能力的研究历来受到国内外关注。它决定了人类与环境交互作用的过程中能否有效地适应高温环境,维持生存。从军事特殊环境医学的角度看,更要求在高温野战条件下保持战斗力。因此,研究热适应现象,探索促进机体热适应能力提高的有效途径,对于提高高温战区指战员工作和战斗效率,减少中暑引起的非战斗减员,具有重要的意义。 探索提高热适应能力的有效途径,必须建立在阐明热适应分子机理的基础上。研究表明,热适应是一个受多因素调控的复杂过程,仅根据目前的研究资料还不足以明确解释热适应现象。因此,全面分离参与热适应的生物活性物质,揭示这些生物活性物质发挥功能的途径,对于系统研究热适应分子机理尤为重要。 目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSll)技术,探讨热适应人鼠肝脏组织基囚的差异表达,力求在坯凶水 平阐明热适应的本质。 方法:将封 6J群同胞、雄性 SD大鼠(n=6)平均分为热适应组(n二3)。 和常温对照组*4人 利用数字化仿真气候室制备热适应动物模型。分 别提取肝脏组织mRNA,采用SSH技术反转录dNA,酶切、接头连接后依 次以热适应组和常温对照组cDNA作为tester,另一组cDNA作为driver 进行连续两次消减杂交。巢式PCR产物连接T载体,转化宿主菌。扩增 目的基因,采用 Differential Screening和 t,ev。rse Northern Blot技 术进行筛选鉴定。阳性差异表达基因送交测序,结果提交GetleB。uk进行 同源性对比分析。 结果:热适应组模型动物获得了充分的热适应。从参比两组大鼠肝 脏组织分别提纯了高质量的总RNA和mRNA,完整反转录为双链cDNA, Rsal彻底酶切,获得了长度均一性较好的短片段。高效连接特定接头, 经过连续2轮消减杂交,构建了上调、下调表达2个热适应相关基因消 减CDNA文库,经检测消减效率较高。巢式PCR扩增特异性高,使差异 表达基因得到了指数扩增。产物连接 T载体并成功转化 TOP OF’大肠杆 菌感受态细胞,侄文库中的差异表达基因得到分离。从上调表达消减文 库中初步分离出 200个目的基因片段,经 Differential Screening和 ,everse Northern Blot技术筛选鉴定,确认其中25个基因为阳性差异 表达基因。测序结果提交GeneBank进行同源性对比分析,确定差导表达 基因的编码蛋白,以及确认新基因。 结论:①首次将抑制性消减杂交技术(SSH)应用于热环境医学领 域的研究,从基因差异表达的角度,系统研究热适应现象的分子机理。 @构建了热适应相关基因上调、下调表达 CDNA消减文库,为进一步分 离热适应差异表达基因奠定了基础。③不同于以往文献从离体培养细胞 水平报道HSP参与热耐受,本实验从基因差异表达的角度,在整体动物 水平发现了热适应动物肝脏组织中也存在着HSP27、HSP86和“肿瘤抑 制蛋白”一p53蛋白编码基因的上调表达,间接证实了热适应机体中存 在HSP27、HSP86和p53蛋白的基础表达升高现象,说明HSP27、HSP86 和 p53参与了热适应分子机制。④发现了 10个在热适应过程中表达上调 的新基因EST,己经全部被GeneBank收录,登陆序列号:BM285377、 -4- BM378053-62。通过在此基础上扩增全长基因,可以表达新的蛋白质, 对深入研究热适应现象具有重要的价值。⑤采用地高辛标记PCR探针替 代了传统 Differential Screening技术的同位素 P‘二dCTP探针,在继承其 高灵敏度和良好特异性的基础上避免了放射性污染,简化了实验操作。


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