基因治疗腰椎间盘退变的实验研究

【摘要】： 研究背景：DDD是骨科医生几乎每天都要面对的临床问题，其发生与DD密切相关。DD的原因多认与椎间盘细胞的生物学特性和营养供应障碍有关。如果能调节椎间盘细胞的生物学特性，促进退变椎间盘的髓核和纤维环细胞分裂增殖，再生髓核内的蛋白多糖和纤维环内的胶原，就有可能阻止DD发展，保持或恢复椎间盘的生理机能。研究发现，生长因子在发育、成熟及退变的椎间盘组织中，对椎间盘细胞的生物学表现具有一定的调节作用。施加生长因子于椎间盘细胞，能促进细胞增殖和蛋白多糖合成，显示应用生长因子或通过促进生长因子在椎间盘内表达，诱导其细胞再生和基质合成，有可能阻止或者逆转DD。由于反复或者持续椎间盘内给入生长因子施行困难，存在感染等并发症风险，有作者以腺病毒为载体，将生长因子基因转染到成年兔髓核组织内，观察到髓核细胞合成生长因子和蛋白多糖的量均有增加，持续可达12w，显示腺病毒载体可以向椎间盘组织转移对其细胞具有治疗作用的生长因子基因，具有一次性使用效应持久、安全及副作用少的优点。因此，基因疗法很有希望成为治疗早期DDD的有效手段，改变传统治疗方法被动滞后的局面。但与正常椎间盘不同，退变椎间盘的细胞数量少，功能不活跃，二者细胞的生物学特性并不一致，而前述实验结果均来自正常椎间盘组织，退变椎间盘的细胞能否被转染，如能转染，转染的效率、生长因子的表达水平及治疗效果如何，均还是未知。如生长因子基因也能转染至退变椎间盘，促进其细胞增殖及基质合成，恢复水和蛋白多糖的含量，从而延缓DD进程，则转基因技术成为预防和早期治疗DDD方法的可行性，又前进了一步。 目的：□造成兔腰椎椎间失稳，诱导DD乃至DDD发生，以摸索运用基因治疗干预DD的具体时机，为进一步研究准备实验对象；□掌握椎间盘细胞的取材与培养技术，了解培养的椎间盘细胞的生物学特性及施加IGF-1对髓核细胞增殖和蛋白多糖合成的影响，为进一步在体内应用IGF-1修复退变椎间盘提供实验依据，并探讨髓核细胞作为髓核组织工程种子细胞的可行性；□将携带入IGF-1基因的腺病毒载体注入兔退变椎间盘，观察生长因子基因能否被转染，转染的效率及表达水平如何，能否促进细胞外基质合成，有无治疗效果，以验证基因治疗对在体退变椎间盘的作用和疗效。 材料与方法:匕选用新西兰兔27只，随机分为手术组15只、对照 组12只，手术组沿玩、棘突作后止中切口，剥离低棘肌和关节突附丽肌 肉，切除棘上、棘间韧带及关节突关协外后l龙;对照组作相同皮肤切口 即缝合，分别于术后2、4、sm对腰椎行X线、MRI、骨密度和组织学检 查，对X线、M叹l和骨密度检查结果作计量分析，组织学检查行H五、 AB.PAS、Masson染色。巴选用Zm龄新西兰兔，处死后取出腰段脊柱和 膝关节半月板，分别取髓核、纤维环和半月板软骨细胞，用含lo%FBS 的nM曰四F】2培养基培养，在倒置显微镜下观察二种细胞的生长情况， 行细胞计数，绘制生长曲线;将IGF一1以不同浓度(0 .Ingjml、1，ong/m!、 10码/ml)作川于原代培养的储核细胞，以MTr、355掺入法观察细胞增 殖及蛋白多糖合成情况:将第2代髓核细胞与脱钙骨材料复合培养48h， 用扫描电镜观察髓核细胞的生长情况。口选用新西兰兔40只，同前法造 成免腰椎椎间失稳，除外感染和恶病质4只，将其余兔随机分为腺病毒转 基因组场只、生长因子组8只、PBS对照组12只，于术后4m经前方或 侧方入路二次手术，显露L、椎间盘，各组分别拄入带人IGF一1基因的重 组腺病毒载体(1内Fu)、价卜1(2鸿)和PBs，于术后1、2、4、8周 行生化和组织学检查，生化检查按Bitl劝r法测定髓核组织中的蛋白多糖含 量，组织学检查行王正、AB于AS、M此SOn及抗人K冷 .1、抗胶原11免疫 组化SABC法染色。 结果:巴术后2至如，对照组腰椎未见异常，手术组L、节段则出 现一系列异常表现。术后2功，椎间盘健核组织几像信号强度明显减低; 术后4m，腰椎旱后凸畸形，椎体楔形样变，骨密度减低，软骨终板钙化 增多，髓核几像信号进一步减低，有后突倾向，光镜下见髓核皱缩、裂 变，细胞数最减少，酸性粘多糖减少，纤维环胶原变性，出现裂隙;术后 名m，椎体楔变和骨密度减低加重，所有椎间盘软骨终板均钙化，多数椎 间隙狭窄，髓核T:像信号减低，后突压迫硬膜囊，髓核内细胞少.见，基 质分散崩解，纤维环破裂，有髓核组织突入。统计学分析显示，手术组与 对照组间X线退变征象发生频数和、软骨终板钙化、几信号强度、骨密 度等的差异均具有显著性意义。只原代培养的二种细胞在形态、增殖能 力上有一定差异。镬核细胞可见两种表型，一种大而亮，内有空泡，近似 脊索细胞，另一种多呈三角或多角形，近似软骨细胞，纤维环细胞多呈短 梭形或三角形，半月板细胞多旱短梭或小圆形;髓核细胞生长较慢，纤维 环与半月板细胞较快:髓核细胞传至第4代后去分化现象明显。原代培养 的髓核细胞在给予不同浓度IGRI后3至gd，细胞增殖和蛋白多糖合成 均有增加，10呵ml与1 on到m盆组作用相近，强于01心ml组。第2代髓 核细胞与脱钙骨材料复合培养4肠后，材料上可见