AGE 激活内皮细胞NF-κB及诱导COX-2表达的机制研究

【摘要】： 背景 AGE是蛋白质、脂类的氨基与糖的醛基之间发生非酶性糖化氧化反应的终产物。随着年龄增大及血糖升高，各种组织中AGE增多。AGE形成在多种疾病如糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔海默茨病、慢性肾衰等病理过程加速，已经证实AGE蓄积和上述疾病的发生、发展及组织病变密切相关。AGE可通过多种受体而被细胞识别，其各种生物学作用可能与其特异性受体RAGE介导有关。已有的研究表明，AGE与RAGE结合可引起细胞内氧化应激，导致核转录因子(NF)-κB的激活，诱导由NF-κB所调控的各种基因的表达。在内皮细胞，AGE可引起粘附分子(ICAM-1、VACM-1)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、E-选择素等基因的表达增强。这些因子的表达可增加内皮通透性，增强炎性细胞的吸附，降低内皮细胞的正常防护功能等，故NF-κB激活引起炎症反应，导致血管内皮功能失调，可能参与AGE相关的疾病的病理进程。揭示NF-κB激活的信号通路有助于认识疾病发生发展，指导疾病的治疗。已发现，AGE引起的氧化应激，参与了NF-κB的激活。AGE引起的氧化应激与NADPH氧化酶的激活有关。NADPH氧化酶的激活可能通过两条途径，其中，佛波醇脂引起的NADPH氧化酶激活由PKC介导，而溶血卵磷脂则通过PTK介导。AGE通过何种途径激活NADPH氧化酶及激活后的NADPH氧化酶如何引起NF-κB的激活目前尚不清楚。已发现， AGE引起的ROS参与了p38 MApK的激活，对单核细胞THpl的研究 发现，p38 MApK介导了NF一KB的激活。在内皮细胞，p38州叭尹K是否 参与了AGE诱导的NF一KB的激活目前尚不清楚。 激活的NF一KB可诱导很多介导免疫和炎症信号的基因表达，环加 氧酶一2(C0X一2)是NF一KB调节的重要蛋白之一。多种因素可诱导COX一2 在内皮细胞、血管平滑肌细胞等多种细胞中的表达，引起氧化应激产生 及炎症反应，参与多种疾病的病理过程。AGE可刺激内皮细胞表达多种 炎症介质，作为炎症介质调节酶的COX一2是否参与AGE引起的病理生 理过程目前尚不清楚。 我们以AGE修饰的人血清白蛋白(AGE一HSA)作为AGE模型，研 究了AGE诱导内皮细胞NF一KB激活的信号传导机制，观察了AGE对 COX一2表达的诱导作用。 方法 我们用DRA病人关节组织研究NF一KB在体内的激活情况，然后选 择体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及内皮细胞株(ECV304) 为靶细胞，观察AGE修饰蛋白对内皮细胞NF.KB激活及COX一2表达 的作用并对其作用机制进行探讨。 1.AGE对血管内皮细胞NF一KB的激活作用。 (1)用免疫组织化学方法检测NF一KB在DRA病人关节血管内皮细胞 中的移位激活情况。 (2)用免疫组织化学法染色检测AGE处理HUVEC后，NF一KB在胞 浆和胞核内的分布变化，用图象分析仪检测分析核浆灰度比值评价NF- KB的激活状况。 (3)AGE刺激ECV304引起的1кBa的变化用节触stern blot检测，NF~ KB的活性用EMSA检测。 2.AGE激活血管内皮细胞NF一KB的机制。 (l)用高铁细胞色素c还原法检测细胞内02一;用琉基反应试剂 TbioGI。一1测定细胞内GSH。不同浓度AGE刺激ECV304，检测细胞内 02一的产生量及GSH的含量变化。用抗氧化剂PDTC预处理ECV304，检 测AGE诱导的02一产生量，1кBQ降解及NF~KB活性改变，观察ROS 在AGE诱导的NF一KB激活中的作用。 (2)用NADPH氧化酶特异性激活抑制剂aPocynin预处理Ecv304，检 测AGE诱导的02一生成量、1кBa降解及NF一KB活性改变，观察NADPH 氧化酶在AGE诱导02一产生及NF一KB激活中的作用。 (3)用PKC抑制剂GF109203及PTK抑制剂Geulstein分别预处理 ECV304，检测AGE诱导的02一生成量改变，观察PKC和PTK在AGE 诱导NADPH氧化酶激活产生02一中的作用。 (4)用p38 MApK抑制剂SBZo358o预处理ECV304，检测A能诱导 的IKB。降解及NF一KB活性改变，探讨p38MAPK在AGE诱导的NF- KB激活中的作用。 3.AGE诱导血管内皮细胞COX一2的表达及机制。 (l)用W七stem blot检测AGE诱导的内皮细胞COX一2的表达。 (2)用NF一KB抑制剂SNSO、1仗Ba抑制剂TPCK、抗氧化剂PDTC和 NADPH氧化酶的激活抑制剂apoc师n预处理Ecv 304，EMsA检测NF- KB的活性，观察它们在AGE诱导的COX一2表达中的作用。 结果 1.AGE可引起血管内皮细胞NF.KB的激活。 (1) DRA病人关节滑膜组织中存在N下~KB的激活。免疫组化结果显 示，晚期DRA病人关节滑膜中血管内皮细胞胞核NF一K BIP“染色阳性， 浸润的单核细胞亦大部分胞核阳性染色，提示NF~KB被激活;早期DRA 病人关节滑膜中未见明显的NF一KB激活。 (2) AGE通过RAGE引起HUVECNF~KB激活。NF一KBIP65免疫组 化结果显示，正常HUVEC细胞浆阳性染色，细胞核阴性;经AGE (5O林岁ml，2h)刺激后，细胞核出现阳性染色，说明AGE诱导NF一KB 从细胞浆向细胞核移位，提示AGE引起NF.KB激活。用可溶性RAGE 与AGE(20:1)预孵育0.5h，可阻断AGE引起的NF一KB从细胞浆向 细胞核的移位。说明AGE引起的NF一KB激活是通过RAGE介导的。 (3) AGE通过诱导IKBQ降解而激活N下~KB。正常ECV304胞浆存 在较高水平1кBa，AGE(50林gl]耐)刺激0.5h，1кBa降解达50%， 2