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短干涉RNA特异性抑制K562细胞肺耐药相关蛋白基因表达的研究

李宁  
【摘要】: 在多种生物中,外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞中,与dsRNA同源的mRNA受到降解,其相应基因受到抑制,称为RNA干涉(RNA interference,RNAi)。这种属于RNA水平上的基因抑制,可能是生物普遍存在的RNA水平上调节基因表达的方式,同时也提供了一种特异性失活功能基因的方法。新近发现,体外合成dsRNA可直接触发RNAi,这些小分子dsRNA被称为小干涉RNA(small interfering RNA)或短干涉RNA(short interfering RNA),即siRNA。多项实验证明,siRNA具有强大、特异的基因抑制功能,对于体外转导的基因和细胞的内生基因同样有效。尤其是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面,既可以特异性抑制、降解同源mRNA序列,有效阻止相应蛋白质的表达,又可避免长链dsRNA引起的非特异性基因降解和细胞死亡。其优点在于:靶序列的识别过程是高度特异的;触发RNAi所需的有效浓度并不高,并可以在RNAi作用中循环产生;能抵抗核酸酶的消化作用。与相应的单链反义寡核苷酸相比,体外合成siRNA造成的基因抑制效率更高、特异性更好,所需有效浓度大大减低。体外合成的siRNA通常由两条互补的核苷酸单链组成,每条单链为21~25 nts,具有5′磷酸基、3′羟基的结构,每个3′端都具有突出的2个碱基。 多药耐药(multi-drug resistance,MDR)造成是白血病化疗失败主要原因之一。与MDR相关的基因和蛋白有多种,肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)是其中之一,它的主要功能是导致细胞内、尤其是细胞核内药物聚集缺陷,因而与多种肿瘤细胞MDR有重要相关性。在白血病细胞中,其表达直接影响着患者化疗的预后,是造成白血病MDR的重要机制之一:在成人急性髓性白血病和儿童白血病中,LRP表达是独立的预后决定因素之一,其过度表达造成患者对化疗不敏感,致使完全缓解率低,完全缓解所需时间长,易复发;难治性或复发性的白血病细胞LRP的过度表达比未经过化疗或化疗敏感的白血病细胞更常见。由于LRP的耐药机制属非ATP依赖性,通常用于逆转P蛋白MDR的药物如维拉帕米、环孢素等对其没有逆转作用。 因此,采用siRNA介导的RNAi技术,阻断L即在白血病细胞 中的过度表达,有望能消除LRP的作用,为逆转其引起的MDR的 基因治疗提供理论基础,开创一条新的途径。 本研究内容包括: ①采用丁酸钠(sodi切叮bu如献e,NaB)诱导K562细胞系,建立 K562细胞高表达LR卫的细胞模型。K562细胞经2 nnno比NaB处理 后,LR卫mRNA水平显著增高;LRP蛋白表达由阴性转为阳性,LR卫 阳性细胞百分率为36%;细胞内柔红霉素(山鱿morUbicin,DNR)蓄积 减少了68.70%,阿霉素(adri田皿ycin,ADM)细胞核分布减少,细胞浆 分布增加。 ②由克隆载体中扩增出LRP全长cDNA,采用粘端连接法,将其克 隆入真核表达载体peDNA3的B别盯Hl和Hindlll酶切位点,成功构建了 LR卫真核表达载体PcDNA3几Rp。测序结果显示基因序列正确,转染 K562细胞能表达LRP基因和蛋白。 ③按照siRNA的设计原则自行设计LR卫特异性siRNA(siRNA- LRP),Blast同源分析未见其靶InRNA与其它基因m丑NA有完全互补 的碱基序列,计算机辅助分析显示该序列适合RNAi作用。 ④采用脂质体转染的方法,用LRP特异性siRNA与LRP真核表达 载体pcDNA3/LR卫共同转染K562细胞,检测siRNA一LRP对LRp基因 和蛋白表达抑制作用的有效性;用siRNA一LRP对绿色荧光蛋白质粒 pEGFP一c1(表达的影响,检测siRNA一LRP对LRP抑制作用的特异性。 结果显示siRNA.LR卫能有效且特异性地在转录后水平抑制K562细胞外 源LR卫基因的表达。 ⑤采用脂质体转染的方法,用siRNA一LRP转染上述由NaB诱导 K562细胞高表达LRP的细胞模型,转染前后结果比较发现,转染后 K562细胞中LRPm丑NA被降解,LRP蛋白表达明显抑制,LRP的作用 被消除,即细胞内DNR蓄积增加,细胞核内ADM增多,胞浆内ADM 减少,恢复到未经处理的K562细胞的水平。 ⑥分别以脂质体包裹siRNA一LRP和空脂质体转染K562细胞,台盼 兰染色检测细胞死亡率,MTT法检测细胞增殖情况,结果显示二者的 一2一 细胞死亡率、细胞增殖无显著差异,表明siRNA一LRP转染K562细胞, 既未引起大量细胞非特异性死亡,亦不影响细胞增殖。 上述实验结果表明,NaB能诱导K562细胞LRP mRNA水平和蛋白 表达增高,LRP表现出减少药物在细胞内蓄积、改变药物核一浆分布、 减少药物在细胞核内分布的作用;自行设计的LRP特异性s1RNA能有 效、特异地降解LRP mRNA、抑制LRP蛋白表达,进而消除其作用, 为进一步开展逆转LRP介导的白血病细胞MDR的基因治疗奠定了实验 基础。


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