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髓鞘碱性蛋白免疫表位肽诱导的淋巴细胞与神经元细胞的相互作用研究

李宏增  
【摘要】: 背景: 多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是以局灶性脱髓鞘为特征的中枢神经系统(CNS)感染性疾病,被认为是髓鞘特异性T细胞介导的自身免疫性疾病。全世界约有110万患者,女性是男性的两倍。MS病因不明,认为环境和基因因素都起了重要的作用,发病率因区域不同而有明显差别;基因组研究发现MS易感基因主要与第6号染色体上的HLA-DR和HLA-DQ的某些等位基因相关。细胞和体液免疫反应都参与了MS的病理损害过程,髓鞘蛋白自身反应性T细胞在MS自身免疫过程中起了非常重要的作用,研究认为髓鞘碱性蛋白(MBP)反应性T细胞可使脑白质内的髓鞘破坏,并引起灰质内神经元继发变性坏死。动物研究证实MS病程中CNS的灰质和白质中都有凋亡细胞出现,凋亡细胞中更多的是淋巴细胞,且凋亡的T淋巴细胞主要是MBP特异性淋巴细胞。 MBP是髓鞘蛋白的主要成分之一,约占髓鞘蛋白质总量的30%。MBP能引起MS的动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。MBP(85-99)免疫表位是MS患者的免疫优势表位,能和HLA-DRB1*1501分子结合,其复合物晶体结构已确定,MS患者的TCR识别DRB1*1501-MBP(85-99)复合物而激活T细胞,T细胞进入CNS后克隆扩增,引起一系列免疫反应导致MS发病,在MS病灶中可以检测到DRB1*1501-MBP(85-99)复合物抗体。 MS病理研究发现,患者脑白质病灶中有T细胞、巨噬细胞的浸润和局部脱髓鞘病变,MS新鲜病灶内T淋巴细胞浸润更多,病理改变不仅累及白质,亦可累及灰质,MS的脑病变不仅有白质髓鞘的脱失,其灰、白质内的神经元细胞也受到侵害。传统理论认为神经元的变性是由髓鞘损害继发引起的,但研究发现活动期MS患者脑脊液(CSF)和CNS病损区有大量的CD4+、CD8+细胞沉积,这些T细胞到底起那些作用,能否直接损害神经元,没有实验研究证实。 目的: 对MS病人自身免疫过程中的自身反应性T细胞的研究虽然很多, 但自身反应性T细胞作用于CNS神经元细胞和髓鞘的形态学研究却匾 乏,其引起MS的作用方式亦大都是理论上的假说,尤其对神经元的直 接研究更加不足。本实验旨在体外研究观察N正P诱导的淋巴细胞能否直 接作用于人脑神经元细胞,使神经细胞变性坏死;如有直接损害作用, 那么鉴定CD4+细胞、CDS+细胞、NK细胞等T细胞亚群到底那种更起 到明显的直接损害作用;检测对神经元和髓鞘直接作用的MBP诱导的淋 巴细胞亚群有无不同,以便进一步探讨MS发病的细胞学机制。 方法: 首先合成MBP免疫优势表位肤段83一ENPVVHR日。qvTpRTp一99 肤段;用MTT法测定MBP合成肤的淋巴细胞转化率并找到其合适的工 作浓度;流式细胞仪测定MBP合成肤诱导的T细胞亚群的变化;用MBP 合成肤诱导培养的淋巴细胞与人脑神经元细胞共同混合培养,进行了扫 描电镜观察,以发现MBP特异性淋巴细胞对神经细胞和髓鞘有无明显的 聚集、薪附和攻击作用,神经元和髓鞘有无损伤;最后用CD分子荧光 单克隆抗体染色方法,鉴定作用于神经元和髓鞘的MBP特异性T细胞 的亚群种类,以便明确CD4+、CDS+细胞和自然杀伤T细胞(NK细胞) 中,叨阵一个亚群起到更明显的直接作用,并比较作用于神经元和髓鞘的 T细胞亚群是否不同。 结果: M竹法测得的MBP(s3一99)合成肤可较好地诱导淋巴细胞转化,其 合适的工作浓度在12.5u留ml以上;流式细胞仪测定MBP合成肤诱导的 淋巴细胞中CDS+细胞比例升高;CD4+,NK细胞变化不明显;扫描 电镜观察发现,MBP合成肤诱导的淋巴细胞与人脑神经元细胞和髓鞘有 明显的聚集、薪附和攻击作用,MBP特异性淋巴细胞不仅直接作用于 轴突的髓鞘,造成髓鞘脱失,还可能直接作用于人脑神经元,使神经细 胞变性坏死;荧光抗体染色法检测到:MBP特异性淋巴细胞中CD4十、 CDS+细胞和NK细胞亚群都对神经细胞有砧附作用,CD4+、CDS+细胞 绝对数较多,NK细胞数较少,还可见到少量的CD3+l CD56+细胞,但具 体作用部位需进一步确定,对神经元和髓鞘直接作用的MBP诱导的淋巴 细胞亚群暂未发现有明显不同。 结论: 合成的MBP(83一99)免疫优势表位肤段能诱导淋巴细胞转化,并使T 淋巴细胞亚群的比例发生变化;MBP特异性淋巴细胞不仅直接作用于轴 突的髓鞘,造成髓鞘脱失,还可能直接作用于人脑神经元,使神经细胞 变性坏死;MBP特异性淋巴细胞中CD4十、CDS十细胞和NK细胞亚群都 对神经细胞有薪附作用,可能这些细胞中的一种或两种直接作用于人脑 神经元,使神经细胞变性坏死,CDS+淋巴细胞可能直接作用于轴突的髓 鞘,造成髓鞘脱失,淋巴细胞的杀伤作用还需进一步探索;淋巴细胞也 存在凋亡现象,多伴随着神经元变性和髓鞘脱失而发生。这种可能的细 胞直接杀伤作用,尤其是对神经元的杀伤作用研究,是一个崭新的观点, 进一步说明了MBP自身反应性淋巴细胞在MS发病过程中起重要作用。 这种直接作用可能是多发性硬化症早期的发病机制之一。 此研究创新之处:在MS发病过程中,MBP特异性淋巴细胞不仅直 接作用于轴突的髓鞘,造成髓鞘脱失,还可能直接作用于人脑神经元, 使神经细胞变性坏死,而且可能不只一种T淋巴细胞亚群发挥作用。这 ?


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