α1，4半乳糖糖基转移酶反义寡脱氧核苷酸治疗卵巢癌的实验研究

【摘要】： 研究背景 选择性地调节与肿瘤发生、发展相关的特异的靶向分子是研究肿瘤有力治疗的基础。鞘糖脂具有多种生物学功能：构成特殊的细胞结构，调节细胞的增殖与分化，参与细胞间以及细胞与基质间的反应，调节蛋白质与受体的行为及其信号传导。它也与肿瘤的细胞生物学活动密切相关，如生长、侵袭、转移和抗原调变等。用不同的鞘糖脂合成抑制剂下调鞘糖脂的表达可以抑制多种肿瘤细胞株的生长和分化，并在裸鼠试验中有抗肿瘤作用。因此，鞘糖脂被认为是一些肿瘤细胞中可以用于干预治疗的、肿瘤相关的靶向分子，目前正在研制各种不同的鞘糖脂抑制剂。红细胞系列鞘糖脂是一种中性鞘糖脂，其组成成分包括Gb3、Gb4、SSEA-3、SSEA-4等。红细胞系列鞘糖脂在卵巢癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、生殖细胞瘤等几种肿瘤细胞中过度表达，并与其临床病理的恶性特征相关。α1，4半乳糖基糖基转移酶(α1，4 galactosy]transferase，α1，4 Gal-T)是红细胞系列鞘糖脂合成的起始酶。它的基因是目前为止所分离克隆出来的基因中唯一与其它半乳糖基糖基转移酶无显著同源性的基因。因此，它是一个很好的、特异的用于抗肿瘤治疗的靶向分子。 反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide，AsODN)能够通过与靶mRNA结合特异地抑制靶基因的表达。某些基因在肿瘤的发生和发展中起着关键的作用。大量的体内外研究显示，针对肿瘤发生和发展的特异基因mRNA的反义寡脱氧核苷酸能够有效地抑制肿瘤细胞的生长。 卵巢癌的死亡率一直高居妇科恶性肿瘤之首。在正常卵巢组织中通常测不到Gb3，但在卵巢良性和恶性肿瘤组织中Gb3含量明显增加。目前为止，发现在继发性卵巢转移癌和耐化疗的卵巢肿瘤组织中Gb3的含量最高。因此，卵巢癌组织中mRNA表达异常的α1，4 Gal-T可能是一个潜在的用于选择性治疗的靶向分子。 研究目的 本研究用硫代磷酸修饰的al，4 Gal一T反义寡脱氧核营酸转染人卵 巢癌细胞株，研究对QI，4 Gal一T mRNA和红细胞系列鞘糖脂表达的影响， 探讨对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、粘附、侵袭、放疗化疗敏感性以及多 药耐药性的作用。旨在研究Ql，4 Gal一T对卵巢癌细胞生物学活性的影 响，寻找一种更有效的反义基因治疗卵巢癌的方法。 实验方法 1.Ql，4Galrr、AsODN序列与。1，4Gal一T mRNA中起始密码子AUG后的 18个碱基序列互补。ASODN序列为5’一GGCGCCCAGGCTGACCAG一3‘， 无义寡脱氧核营酸(NOoN)序列为5‘一GACCGTCGCGTGCACTGT一3‘。寡 核昔酸的两端各一个碱基进行硫代修饰。脂质体转染剂与寡核营酸按 6:1的重量比例混合制成脂质体一反义寡脱氧核营酸复合物。以终浓 度为10以mol/L的ASODN与人卵巢癌细胞株COCI细胞共反应72h， 用RTPCR检测转染后Ql，4 Gal一T二RNA的表达;HPTLC检测转染后 中性鞘糖脂的含量:流式细胞术检测Gb3的表达及其与。1，4Gal一T A、ODN作用剂量和时间的关系。 2.ASODN对COCI细胞的增殖抑制作用:用克隆形成试验检测不同浓度 和不同时间条件下A:ODN转染后COCI细胞的克隆形成率;流式细胞 术检测对COCI细胞周期的影响。 3.A、ODN对COCI细胞的诱导凋亡作用:用AnlleXin护工双标法、细胞总 DNA琼脂糖凝胶电泳以及透射电镜检测COCI细胞的凋亡状态;流式 细胞术检测转染后l)53、Bcl一2、Bax和Fa、蛋白表达的改变。 4.ASODN抗卵巢癌细胞粘附性和侵袭性的作用:用体外粘附实验检测 A只ODN对卵巢癌SKOV3细胞的体外粘附抑制作用。用FCM检测A、ODN 对COCI细胞表面CD44和MMP一9表达的影响;Boyden小室法检测对 COCI细胞体外侵袭性的影响。 5.AsODN对COCI细胞放疗敏感性的影响:用克隆形成试验检测COCI细 胞的放疗敏感性;Annexin/肛双标法检测A、ODN与放疗联合作用后 COCI细胞的凋亡率。 A:ooN对COCI细胞化疗药物敏感性的影响:用克隆形成试验检测与 化疗药物联合作用后COCI细胞的克隆形成率:用A朋e，1 n/PI双标法 检测ASODN与泰素、顺铂联合作用后COCI细胞的凋亡率。 AsODN逆转Cocl/DD尸细胞多药耐药性的作用:流式细胞仪检测 COCI/DDP细胞Gb3的表达;MTT法检测ASODN对COCI/DDP细胞耐药 性的逆转作用:流式细胞仪检测对COCI/ODP细胞MRP、 GST一“、LRP、 BCI一2和Bax表达的影响。 动物试验:观察AsODN对COCI细胞裸鼠致瘤性的改变。 实验结果 (一)al，4 Gal一T mRNA对卵巢癌COCI细胞红细胞系列鞘糖脂合成的抑 制作用 1.经微机检索进行人类基因库同源性分析显示，本研究所应用的Q 1，4Gal一T基因As0DN与其它的人类基因无互补结合的碱基序。RT一PCR 结果显示AsODN显著抑制COCI细胞中al，4Gal一T mRNA表达，抑制 率达85%。 2.HPTLC结果表明在As0DN作用72h后，COCI细胞CTH和Globo:id。的 表达受到显著抑制，而CMH、CDH表达未受到明显影响。- 3.流式细胞术结果显示A、ODN转染后的COCI细胞Gb3表达与NOON组和 对照组相比受到显著抑制，并且其抑制作用存在浓度和时间的依赖 性。 (二)。1，4 Gal一T AsODN对卵巢癌C