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白藜芦醇对大鼠急性脊髓损伤后的神经保护作用与机制

杨迎暴  
【摘要】: 目的 利用在体大鼠急性脊髓损伤(SCI)模型,研究SCI后使用白藜芦醇(resveratrol,Res)对继发性脊髓水肿、受损局部组织结构的形态学、乳酸(LD)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na~+,K~+-ATP酶活性、Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP酶活性、Ca~(2+)、Mg~(2+)离子水下、自由基水平与脂质过氧化反应、超氧化物歧化酶(SOD)、神经微丝蛋白(NTF)、微管相关蛋白2(MAP2)及微管相关蛋白Tau(Tau)的影响。同时,通过体外培养脊髓神经细胞并制成细胞损伤模型,研究Res的神经细胞保护作用机制。 方法 在体内实验中,采用重物下落撞击法(weight-dropping)制备成年大鼠的脊髓损伤模型。于损伤后即刻腹腔注射给予Res 50mg·kg~(-1),100mg·kg~(-1)或甲基强的松龙(MPSS)100mg·kg~(-1),观察给药后1h、24h、48h时各组受损脊髓组织含水量、LD、LDH及Na~+,K~+-ATP酶活性、Ca~(2+)-ATP酶活性、Mg~(2+)-ATP酶活性、Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP酶活性、Ca~(2+)、Mg~(2+)离子水平、活性氧(ROS)水平、氧自由基清除剂SOD活性与脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)的变化,同时对组织形态学结构超微变化和神经细胞骨架蛋白的变化进行观察。其中,组织含水量的测定采用干重法;LD、LDH及Na~+,K~+-ATP酶活性、Ca~(2+)-ATP酶活性、Mg~(2+)-ATP酶活性、Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP酶活性、ROS、SOD与MDA测定均采用根据特定方法设计的试剂盒:Ca~(2+)、Mg~(2+)离子水平测定采用原子吸收法;组织形态学实验采用电子显微镜观察法;神经细胞骨架蛋白含量测定采用Western blotting。 在体外实验中,以H_2O_2损伤培养的脊髓神经元制备过氧化损伤模型,观察Res 1 μmol/1-20 μmol/1对受损伤神经元生长活性、细胞Ca~(2+)水平、超氧自由基、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响。 其中,MTT法和流式细胞术用于观察细胞生长活性情况;荧光分光光度 法、化学发光法分别用于测定ca2+、超氧自由基;No和Nos采用根据 特定方法设计的试剂盒进行测定。 结果体内实验通过重物下落撞击法成功制备成年大鼠的SCI模型,其 不仅使受损局部的组织水肿,还引起组织形态学结构的明显改变和具有 显著统计学差异的能量代谢系统障碍、自由基产生与脂质过氧化反应活 跃、部分电解质水平紊乱和c犷斗,Mg2+-ATp酶活性等微环境变化以及神 经细胞骨架蛋白含量的改变。因此,这种SCI模型可以应用于Res的药 效学研究。 Res能够显著抑制scl后继发性水肿。scl后lh时,Res 50 mg·掩“, 100 mg·吨一,及MPss对组织含水量无明显影响;Res 100 mg·kg-,在 24h与48h均可明显减少组织含水量(尸0.05),但MPSs组均无统计 学意义,提示Res对SCI后脊髓组织水肿有明显的减轻作用,且山抑制 率可见,随着时间的延长,Res对水肿的抑制率逐渐增强,以48h时作 用最明显,其100 mg·kg一,组的抑制率在11.5%左右。电子显微镜的结 果表明,ReS和MPSS均能有效保护 SCI后脊髓组织的超微形态结构的 正常性,lh,24h,48h的所有样本均未见严重的组织形态学改变,神经 丝基本正常,特别是在24h与48h的样本中神经丝密度几乎与正常无异, 髓鞘层的排列规律,神经元改变也非常微小,偶见胞浆中有轻度水肿和 极少的较大空泡,基本结构与正常极其相似,而且细胞器无明显变性, 形态正常的线粒体其峭清晰可见,仅见少数线粒体有肿胀或少峭现象, 细胞核基本正常。 Res可以抑制sCI后受损局部LD、LDH水平的升高和Na+,K+.ATp 酶活性的降低,提示其对SCI所造成的组织细胞能量代谢系统损害有改 善作用。ReS 50 mg·kg一‘,1 00 mg·kg一‘及MPss对sel后lh的受损局 部组织LD均有一定程度的降低,但无统计学意义,在24h与48h时, 两药则均显著降低受损局部LD水平(尸0.01);sCI后lh、24h时, 与模型组相比,Res 50mg·叮,组和MPss组的LDH水平均显著性降低 (p0.05),Res 100 mg·kg-‘组在24h、4sh有非常显著差异(尸0.01), MPSS组在48h时无显著性影响;在SCI后lh时,Res与MPSS对Na气 K+魂Tp酶活性无显著影响(尸0.05);24h时砒s一00 mg·kg-‘与MPss 均对Na+,K+一开酶活性有显著影响(p0.05);4sh时,既5 100 mg’kg-‘组对Na+,K+.ATP酶活性有显著改善作用(尸0.01),MPss无 影响。 scl后脊髓受损局部的c扩十、M犷十离子水平、c扩十~ATP酶、M犷十一TP 酶及c扩十,M扩十一TP酶活性均发生显著性孪化,Res 1 00 mg·kg-,对这些 指标均表现出明显的调节和改善作用。 SCI后脊髓受损局部的氧自由基水平明显升高,脂质过氧化反应显 著激活。Res 50 mg·kg一,与1 00 mg·kg-,均能够显著提高scl后损伤部位 soD水平和抑制脂质过氧化反应产物MDA生成(尸0.01),特别是在 48h时作用最为明显;同时,Res显著降低Ros水平(尸0,01),也以 48h作用最强,抑制率大于40%,且有明显剂量依赖性,作用与MPSS 相当或更优。 此外,实验结果表明, SCI可以使神经细胞的骨架蛋白包括NTF、 MAPZ及Tau受损,使之在急性期中含量明显减少,而Res和MPSS均 可以有效防止上述细胞骨架蛋白的降解。 体外实验中,H20:200 pm。


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