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表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究

胡贵方  
【摘要】: 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的严重威胁人类健康的传染性疾病,目前全球范围内大约有超过3.5亿人受到HBV危害。大约有15~40%的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区,现患慢性乙型肝炎的病人已突破1000万。迄今为止,慢性乙型肝炎的治疗仍无良策,因此,研制新型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒(adeno-associated vires type 2,rAAV-2)作为一种大有希望的基因转移载体,因能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此,本研究以研制新型HBV疫苗为目的,构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2,初步研究了其免疫原性,并探讨了表达HBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—1质粒中扩增HBV(ayw亚型)外膜主蛋白(HBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因;将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK—21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg;用具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc/ΔUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg,纯化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg;用高效液相色谱仪(HPLC)检测和SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的纯度;以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度;ELISA检测混合细胞系 博士论文:,、HB、,卜膜主蛋。、、蛋。、重组腺,关病毒的构减巍免。性研究 BHK一HBsAg和BHK~LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达,rAA认HBsAg和 rA戌认LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明,H卫LC分析显 示主峰为总面积大于99%;SDS一PAGE电泳结果显示3条特征性条带,其间的 杂蛋白量非常少;点杂交检测rA戌瞬2一HBsAg和rAA认2.LHBsAg的物理滴度分 别为sxlo,‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil(vp翔吐);混合细胞株BHK一HBsAg中 HBsAg的表达量为28.6士6.7ng乃x ro6eells,BHK~LHBsAg中HBsAg的表达量 为15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌认2~HBs^g和rAAv-2~LHBsAg感染BHK一21 细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数(伽ltiplicityof infection,MOI)的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能 有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg,为下一步工作奠定 了基础。 本文首次报道了rA戌认2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通 过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径,我们观察了rA入v-2~HBsAg 和rAA认2.LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBv抗原特异性的体 液和细胞免疫反应的能力。结果显示,rAAv-2~HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通过 肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg, 同一给药途径,rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2~LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水 平无明显差异(p0 .05);同一重组病毒(rA戌认2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg) 不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异(p0 .05)。重组病毒通过不 同途径在小鼠体内表达的同时,可在较长时间(80天)诱导小鼠产生HBV抗原 特异性的体液和细胞免疫反应:不同给药途径之间的免疫效果比较发现,肌肉注 射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲都能诱发机体产生HBV保护性抗体和激发CTL 产生,但以尾静脉注射效果最好,腹腔注射、肌肉注射和胃饲三者之间差别不大 (p0 .05);在各种给药途径中,免疫反应能否出现、以及免疫反应的强度与剂 量(给予的重组病毒颗粒数)有关。结果提示,基于rAAV载体的HBV疫苗, 对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗和应用于对现有 HBV疫苗无反应的患者无疑具有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究。 近年来,以DC为基础的免疫治疗已成为抗肿瘤和抗感染等研究的热点,本 文也探讨了表达HBV抗原基因的rAA认2载体用于DC为基础的慢性乙型肝炎免 疫治疗的可行性。首先,我们用表达报告基因一绿色荧光蛋白(GFP)基因和荧 光素酶(luciferase,Luc)的rA月认2(分别简称为rAA认GFP和rAAV-Luc)感染 了人外周血单核细胞来源DC以观测感染效能,在激光共聚焦显微镜观察了F仃C 博士论文:表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究 (fluorescein 150而Ocyanate,FITC,异硫氰酸荧光素)标记的rAA认2进入Dc的 动态过程;结果显示,激光共聚焦显微镜下观察到了rAAV-2能进入DC;只有 当Mol(multiplicity of infeetion,感染复数)大于1 X losvp/c ell时,乙AAV-2一lue 和rA戌认2一GFP才能有效感染DC,需较高的MOI值的重组病毒才能有效感染 Dc,报告基因的表达水平在MOI值为1 X 105一5 x 106vPlcell之间呈剂量依赖趋 势,此后再提高MOI值并不能明显提高表达水平,感染后的DC表达水平不高。 表明rAA认2可以有效感染DC,但转导效率


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