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环孢霉素A对NIT—1胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌的影响及其在基因水平上的作用机制

余乐  
【摘要】: 目的 环孢霉素A(cyclosporin A, CsA)是一种强效的免疫抑制剂,被广泛地用于治疗心脏、肾脏、肝脏,胰腺和肺等多种器官和细胞移植后的排斥反应,早期应用环孢霉素A治疗还可以延缓自身免疫过程导致的Ⅰ型糖尿病。但是,很多报道也指出环孢霉素A有影响胰岛β细胞功能破坏糖耐量导致糖尿病的副作用。本实验通过体外实验,观察CsA对NIT—1胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌的影响,研究CsA对细胞的直接作用。同时检测CsA对NIT—1胰岛B细胞DNA多聚酶α催化亚单位1(Polα1),线粒体氧化磷酸化酶系中几种主要成员和线粒体核糖体蛋白基因表达的影响,从基因水平探讨CsA对细胞增殖和胰岛素分泌影响的作用机制。方法与结果根据实验目的,本文的实验可分为二个部分:1、CsA对NIT—1胰岛β细胞增殖的影响及其在基因水平上的作用机制体外培养NIT—1胰岛β细胞,用不同浓度的CsA(0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10μM)分别处理24h,48h和72h后,以MTT法检测药物对细胞增殖的影响,实验结果表明,CsA对NIT—1细胞增殖的影响具有双向性。不同浓度CsA处理NIT—1胰岛β细胞24h后,较高剂量的CsA(≧5μM)可促进细胞增殖;处理NIT—1胰岛β细胞48h和72h后,CsA对细胞增殖产生抑制作用且随着剂量的增加抑制作用越明显。CsA浓度为10μM时,处理NIT—1胰岛β细胞24h后促进细胞增殖的作用和处理48h和72h后抑制细胞增殖的作用均达到最大,并且在48h和72h之间10μMCsA完全抑制了细胞的增殖。为了从基因水平上检测CsA对细胞增殖的影响,用半定量RT—PCR法检测10μM CsA处理细胞24h和48h后,对Polα1 mRNA表达的影响。结果表明,10μMCsA处 理Nrr一1胰岛p细胞24h后,引起Pol Q 1 mRNA表达上调,与 对照组相比其上调的百分率为34.5%:而处理48h后,引起PolQ 1 mRNA表达下调,与对照组相比其下调的百分率为20.6%。这一 作用与CsA对Nrr一1胰岛p细胞增殖的双向性影响相一致,即在 处理24h后起促进作用,而48后起抑制作用。 2、CsA对NIT一1胰岛p细胞胰岛素分泌的影响及其在基因 水平上的作用机制体外培养Nrr一1胰岛旦细胞,用不同浓度的 CsA(0.01,0.05,0.1,0.5,l,5,10冬功改)分别处理24h,48h和 72h后,以放射免疫测定法(犯A)检测药物对细胞累积胰岛素分 泌的影响,结果显示用不同浓度的CsA处理Nrr一1胰岛p细胞 24h,48h和72h后,均可引起细胞胰岛素分泌的下降,且随着csA 剂量的加大抑制作用越明显。相同的培养条件下,用不含葡萄糖 的KRBH缓冲液预孵育3Omin,再加入含不同浓度CsA的 KRBH 缓冲液(分别含葡萄糖3”M和25“M),孵育lh,以放射免疫测定 法检测药物对细胞基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激性胰岛素分泌的 影响,结果表明CsA短期处理细胞后可促进基础和葡萄糖刺激的 胰岛素释放,并具有一定的剂量依赖性.并用半定量RT一PCR法 检测10卜功吐CsA处理细胞24h和48h后,对线粒体氧化磷酸化酶系 中6种主要酶(NuoxgsNuox23,Uqc几Cox7e,Atpso和AtP5k)和线 粒体核糖体蛋白(M印113和M印52 1) mRNA表达的影响,结果显 示,用10pM CsA处理细胞24h和48h后均可不同程度的抑制线粒 体氧化磷酸化酶系中6种主要酶mRNA的表达,处理24h后对 Nuoxg,N uox23,Uqer,Cox7e,Atpso和AtP5k mRN^表达的抑制率分 别为23.7%,30.7%,25.1%,19.5%,10.0%和35.7%;处理48h 后的抑制率分别为22.8%,50名%,71 .2%,31 .7%,22.6%和64.8 %.10附csA处理细胞24h后对线粒体核糖体蛋白(M印113和 M印521) mRNA的表达几乎没有影响,处理48后,可明显地抑制 其表达,抑制率分别为22.6%和63.0%。 结论 1、CsA对Nrr一1胰岛p细胞增殖的影响具有双向性。较高剂量 的CsA(之5林M)处理细胞24h后可促进细胞增殖,处理48h 以上则抑制细胞增殖,并具有一定的剂量依赖性。 2、CsA处理NIT一l胰岛p细胞24h,48h和72h后,可抑制细胞 累积胰岛素分泌,其抑制作用具有剂量依赖性,即随着剂量的 增加抑制作用越明显。 3、CsA处理Nrr一1胰岛旦细胞1h后,可促进基础和葡萄糖刺激 性胰岛素释放。 4、10卜功改CsA处理NIT一l胰岛p细胞24h后,可上调Pola lmRNA表达,处理细胞48h后,对Pol Q lmRNA表达则产生 下调作用。 5、10IJM CsA处理NIT一1胰岛p细胞24h和48h后,可下调NIT 一1胰岛p细胞线粒体氧化磷酸化酶系基因的表达,除了对 Nuoxg mRNA表达的抑制作用在24h和48h没有明显区别外, 对其它5种酶(Nuox23,U够r,Cox7e,AtP5o和AtP5k)mRNA 的表达随着药物处理时间的延长,抑制表达的作用越明显。 6、10卜功涯CsA处理NIT一1胰岛p细胞24h对线粒体核糖体蛋白基 因(Mrpll3和M印52 1) mRNA的表达没有明显的抑制作用, 处理48h后对其表达具有明显的抑制作用。


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