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应用抑制性消减杂交技术研究兔外周血单核细胞热适应相关基因的差异表达

于磊  
【摘要】: 高温作为军事职业危害因素日益受到重视,人体在高温条件下适应与耐受能力的研究成为热点。在热环境下,机体的代谢、免疫状态将发生改变,细胞出现一系列生理、生化、结构和功能的改变,以增强抗损伤能力,保持内环境的相对稳定,使机体逐渐适应热环境。传统技术在研究人与动物热应激及热适应过程的病理生理机制过程中,已经取得了较大的进展,但热适应过程的诸多分子生物及生化机制仍未完全阐明。目前已知在有害因素刺激下以及在适应过程中,一些基因调控机制扮演着十分重要的角色。推测其主要通过一些调控蛋白、因子(如一些酶类、激素等)的差异表达(异位表达或表达增强)来增强机体的适应与抗损伤能力。因此研究热应激及热适应过程基因的差异表达,有重要的科学意义。 目的:应用分辨率高的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,探讨兔外周血单核细胞热适应相关基因的差异表达,为提高热适应能力和寻找相关的生物标志物提供理论基础。 方法:常规方法建立兔热适应模型,分别于兔热适应前和热适应后取其外周血,分离单核细胞,提取其总RNA,逆转录后利用SMART~(TM)技术合成cDNA,酶切后分别连接不同的接头,进行两步消减杂交、两轮PCR来扩增差异表达基因片断,构建消减cDNA文库,最后应用differential screening技术对所构建的文库进行筛选,鉴定阳性克隆并测序,登陆GeneBank进行同源性比较。 结果:实验兔获得了充分的热适应;分别从热适应前、后兔外周血中分离 了高纯度的单核细胞,并提取了高质量的总RNA,完整反转录为全长。DNA。Rsa I酶切彻底,获得长度均一性较好的短片断。高效连接特定接头,经过连续两 轮PCR消减杂交,构建了上调、下调的热适应相关基因消减cDNA文库。随后 的两轮PCR扩增特异性高,使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接T载体 并成功转化DH5a大肠杆菌,使文库中的差异表达基因得到有效分离。从上调 表达消减文库中初步选取96个克隆进行筛选,利用Differentials。reening 鉴定后确定7个克隆含有差异表达基因。测序结果提交GeneBank进行同源性 对比分析,确定差异表达基因的编码蛋白,以及确认新基因。最后分析显示1 个为未知基因,另6个为已知基因。 结论:成功应用抑制性消减杂交技术研究动物研究了热适应兔外周血单核 细胞热适应相关基因的差异表达,构建了外周血单核细胞热适应相关基因的上 调、下调cDNA消减文库。发现了线粒体细胞色素。氧化酶亚单位(C 011)编 码基因、线粒体ATP合成酶6(ATPse6)编码基因、线粒体165 rRNA、125 rRNA 编码基因、蛋白激酶B(PKB)编码基因、p一2微球蛋白(BZM)编码基因片断 等在热适应过程中的上调表达。另发现了1个未知新基因片断在热适应过程中 表达上调,但具体功能仍有待于进一步的研究阐明。研究表明基因调控在热应 激及热适应过程扮演着重要的角色,同时也证明SSH技术能够高效地将差异表 达基因分离扩增。


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