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三七总皂甙对人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性的影响

张丽华  
【摘要】: 一.目的 一氧化氮(nitric oxide,NO)是以左旋精氨酸为底物在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的作用下生成的,目前发现了3种NOS的同工酶:诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS),内皮源性一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)和神经源性一氧化氮合酶(neuronal NOS,nNOS),其中eNOS和nNOS属于固有型的NOS(constitutive NOS,cNOS),而iNOS则为诱生型的。eNOS主要存在于血管内皮细胞中。生理状态下内皮细胞释放的NO主要由eNOS催化合成,所生成的NO的量虽然很少,但对于维持血管平滑肌张力和正常血压具有重要作用。 冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)与冠状动脉痉挛(coronary spasm)并称冠状动脉性心脏病(coronary heart disease,CHD),即缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD),是危害人类健康的一类重大疾病,全球的医学科学工作者已对其进行了广泛而深入的研究。日本学者研究发现:高血压作为冠心病发病的高危因子之一,高血压病人和冠状动脉痉挛患者的eNOS基因5'-侧翼启动子区发生了T~(-786)→C的突变,研究结果提示缺血性心脏病与eNOS基因之间存在着高度的关联,这就为该类疾病的发病机制提出了新的学说,亦为其预防和治疗提出了新的契入点。 中药复方定心方(Dingxin recipe,DXR)是临床用于预防和治疗缺血性心脏病的卓有成效的经验方剂,先前的研究表明:DXR能通过增加血中NO含量而拮抗心肌缺血或缺血再灌注(MI/R)损伤所致的心律失常。但具体机制尚不清楚。田三七【Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen】是DXR的主要药物组成,现代药理研究发现,三七总皂甙(total Panax Notoginseng Saponins,tPNS)是田三七的主要药用活性成分,其主要成份为人参皂甙Rb1,人参皂甙Rg1和三七皂甙R1。基础和临床的研究均证实tPNS具有扩张冠状血管,增进冠脉循环的效应,还可抑制血管平滑肌细胞的增殖,抑制血小板聚集和血栓形成,在动脉粥样硬化及缺 血性心脏病的预防和治疗方面发挥了重要作用。现己被制成多种制剂, 在临床广泛应用[‘6]。不论是内源性的或者是外源性的NO对各种血管(动 脉,静脉,体循环,肺循环,冠状动脉等)都引起舒张反应,而tPNS 可促培养的猪主动脉内皮细胞(PAEC)合成并释放Nol,2],进而推定tpNs 的扩血管功能主要是通过NO而发挥作用。近年来,就tPNS在细胞水平 促NO生成的可能作用机制已有很多阐述。 从人eNOS基因被克隆以来,国内外学者己对其转录调控进行了研 究[5, 6,331。研究中药在基因转录水平上的调控作用是近年来中医药学界的 重点和热点[2,3],从基因表达调控方面来研究中药作用机制将会从更深的 层次、更本质地揭示中药的作用机理。本实验主要探讨三七总皂贰(tPNs) 对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制, 从基因转录水平阐明tPNS促NO生成的可能作用机制,为DXR增加血 中NO含量,防治缺血性心脏病的临床应用提供理论和实验依据。 二.方法 以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(一1一1 600bp)驱动的 萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS一Luc,采用脂质体介导的细胞基因 共转染技术将peNOS一Luc,空载体pGLZ一Basic和p一半乳糖昔酶表达质 粒pCMV一p共转染鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS), tpNs和转移生长因子pl(TGFpl)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细 胞,检测并比较荧光素酶/p一半乳糖营酶活性,以确定LPS,tPNS和 TGFpl对人eNoS基因启动子转录活性的影响。 三.结果 1.酶切和测序结果均证实重组载体peNOS一Luc构建正确。 2.质粒pose书osRed和重组载体p州05一Luc在NIH3T3细胞中有效 表达。 3.在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在企NS和 TGFpl刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFpl较tPNS所致的 转录活性更强。 4.tpNS拮抗LPS对人eNos启动子转录活性的抑制作用。 四.结论 1.正确地构建了人eNos基因启动子区(一l一1 600bP)驱动的萤火 虫荧光素酶报告基因载体peNoS一Luc。 2.pnse一NOsRed和peNOs一Lue具有报告人eNOs启动子转录活性的 功能。 3.从基因转录水平阐明了tPNS促NO生成的作用机制,为DXR防 治缺血性心脏病的临床应用提供理论和实验依据。 4.为中医药复方研究提供了新的思路,为中药在基因水平卜:的作用 找到了新的药物靶标。


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