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野生型MEF细胞与缺失PLC-γ1基因的MEF细胞总蛋白质表达谱差异的研究

邹志鹏  
【摘要】: PLC-γ1在细胞的生长与分化、生物体的发育、细胞转化以及氧化应激中发挥着重要的作用。鉴于PLC-γ1发挥上述作用的机制尚未完全阐明,PLC-γ1通路与其他信号通路间的交联和代偿尚无系统报道,又因为以往的研究方法不够全面,本研究以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(PLC-γ1~(+/+))和缺失磷脂酶C-γ1的小鼠胚胎成纤维细胞(PLC-γ1~(-/-))为研究模型,在众多蛋白组学策略中选择了双向电泳+质谱(2-DE+MS)作为研究手段,通过对比表皮生长因子(EGF)刺激24小时后上述两种细胞的总蛋白质表达差异,全面地探讨敲除PLC-γ1对生长因子诱导的信号传递的影响,从而间接研究PLC-γ1生物学作用、信号传递机制及其代偿情况,为后续的深入研究打下基础。 本研究首先优化了总蛋白抽提方法,构建了清晰的、高分辨率的合成图谱(COMPOSITE MAP),摸索了适合本细胞株的蛋白质染色方法,其低背景、高灵敏度及与质谱兼容的特性是后续的肽指纹图谱(PMF)分析的前提条件。 在完成对实验方法的优化后,以EGF刺激24小时后野生型MEF的双向电泳图谱作为对照,与敲除PLC-γ1基因的MEF细胞的双向电泳图谱进行比较,共进行了3次重复实验,获得较好的重复性和可比性。凝胶图象经MELANIE 3.02软件分析表明:野生型MEF组和敲除型MEF组约有1450±100个蛋白质斑点可被检测;以匹配斑点的校正光密度值(%vol)进行相关性统计,野生型MEF组的组内相关系数为0.858、0.867、0.875,而敲除型MEF组的组内相关系数为0.842、0.846、0.863。经过软件分析和手工修正,挑取了7个在两组凝胶中不能匹配的蛋白质斑点(一组存在而另一组消失),目前已对其中3个进行了质谱鉴定,其中一个确切鉴定为vimentin,而另外两个不能得到鉴定。Vimentin是一种第三类中间纤维,与c-fos、c-jun和CREB具有较高的同源性,在细胞分裂时常常大量地重新组织,发生显著的磷酸化。Vimentin还常常调节蛋白的转位和信号的传递。实验结果显示:经过EGF刺激24小时后,相对于野生型MEF 组,敲除型MEF组的2一DE图谱中代表Vimeniin的蛋白斑点消失, 暗示缺失PLc一Y1基因可能直接或间接导致了Vimentin的不表达, Vimentin是否是PLC一1通路的下游事件,以及是否是PLC一Yl通路 与其他信号通路的交叉点,尚需结合其他方法进行深入研究。 下一步的研究将继续深入探讨Vimeniin与PLC一1通路的关系, 同时使用合成双向电泳图谱(COMPOSITEZ一DE MAP)以比较生长因 子刺激后PLC一Yl‘八与PLc斗1一的总蛋白表达差异,力求发现更多的 表达差异的信号分子。随后辅以其他手段如酵母双杂交、免疫印迹、 免疫共沉淀等更为深入地研究这些信号分子与PLC一丫1的相互调节 机制。


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