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晚期糖基化终产物受体胞外段和胞内段的克隆、表达、纯化及功能研究

赵善超  
【摘要】:背景 晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)是一种膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族。人RAGE由404个氨基酸组成,分别由较大的细胞外段(321个氨基酸残基)、跨膜段(19个氨基酸残基)及短的细胞内段(41个氨基酸残基)3个部分构成。氨基酸序列分析表明,RAGE为免疫球蛋白超家族的新成员,它与免疫球蛋白超家族中的MUC18糖蛋白、神经细胞粘附分子(nerve cell adhesion molecule,NCAM)及CD20胞内部分的氨基酸序列高度同源。可溶性RAGE(soluble RAGE,sRAGE)即RAGE胞外段,为配体结合部位,具有V型片段紧接两个C型片段的免疫球蛋白样结构,每个都含有一对保守的半胱氨酸残基,V型片段还含有两个与N偶联的糖基化位点,这些对于RAGE分子结构的稳定性和特异识别配体的功能具有重要意义。在胞外段之后是一个跨膜区和一条带有高度负电荷的胞质尾巴。胞内段RAGE与B细胞激活标记CD20具有高度同源性,该段很可能在配体占领受体后结合胞浆内信号转导分子,产生细胞效应。RAGE虽然是由于与AGE相互作用被发现并因此得名,但其配体并不是一段简单的多肽,而是一个配体家族,包括晚期糖基化终产物 (advanced glyeation end products,AGE),双性素抽力pboterin), 淀粉样p多肤(娜yloid一pp即tide),细胞外新鉴定的RAGE结合 蛋白(extracellular newly identified RAGE七访ding protein, 阴一RAGE),高迁移率族蛋白BI(high mobility grouP protein BI, HMGBI)等,这些配体分别与RAGE相互作用,在各种疾病中扮 演着不同的角色,这使得对RAGE功能的研究更有意义,但也在 一定程度上增加了研究的复杂性。 RAGE对AGE进行结合、内吞,并使其降解是它最基本的功 能。这一功能在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神 经细胞及血管平滑肌细胞等细胞中均有表现。在AGE与RAGE结 合并摄入细胞内这一过程的同时启动了AGE的病理效应:通过 PKe、PTK、PZ IRAs、E双l甩、p3s MApK、氧自由基、NF一虑等 环节,激活细胞内多种信号转导机制,产生氧化应激,激活核转 录因子NF一祀,引起白细胞趋化;触发各种细胞因子的分泌,包 括TNF一a、IL一l、IL一6、PDGF、及vACM一1等等,引起炎症反应; 刺激结缔组织细胞异常增生;促使血管内皮细胞通透性增加,血 管基底膜增厚变硬;诱发血栓形成;与系膜细胞作用促使肾脏基 底膜成分大量增殖,导致肾小球硬化;介导成纤维细胞、平滑肌 细胞增殖,从而引起各系统和脏器的一系列病变,在糖尿病慢性 并发症、透析相关性淀粉样变(dial”15一ated amyloidosis,D双)、 阿尔采默氏病(^一zheimer,5 disease,AD)、动脉粥样硬化等疾病发 生中起着重要作用。对RAGE结构和功能的认识可能为这些疾病 的防治提供新靶位,因此具有重要意义。 随着对RAGE研究的不断深入,研究者们更加深刻地认识到, 阻断RAGE与其配体的结合效应,对于这些疾病的预防和治疗具 有重要意义。抗RAGE抗体和sRAGE是公认的阻断剂。sRAGE 是RAGE的细胞外段部分,它可特异结合AGE,但由于不具有胞 内段部分,所以不介导生物效应。在体内,用sRAGE治疗载脂蛋 白E缺乏的糖尿病鼠,可完全抑制糖尿病性动脉粥样硬化的形成。 大量体外实验也证实,sRAGE对由RAGE介导的AGE所引起的 血管通透性增加及氧化应激等有阻断作用。而抗RAGE抗体则是 通过封闭细胞膜表面RAGE,使其不能与AGE结合,从而达到阻 断AGE进入细胞内的目的。因此,利用抗RAGE抗体或sRAGE 阻断RAGE介导的病理效应,将会为这些疾病的治疗提供新方法。 国外学者已成功克隆了RAGE胞外段,获得sRAGE蛋白,并以其 为抗原制备了抗RAGE抗体,但这些研究结果尚未商品化。国内 尚无人克隆RAGE,因此阻碍了对AGE.RAGE病理生理研究的进 展。RAGE胞内段尚未见克隆成功的报告,RAGE在细胞内首先与 哪些蛋白相互作用也尚未被阐明。本研究的目的是分别构建和表 达人RAGE的胞外段和胞内段,鉴定其生物学功能,筛选可能与 RAGE胞内段相互作用的功能蛋白,从而为进一步深入研究RAGE 的细胞内信号转导途径奠定基础。 方法 1.RAGE胞外段和胞内段融合蛋白的获得 (l)应用亚克隆的方法,构建了RAGE胞外段和胞内段的表达载 体,其中胞外段构建于带有His标记的pET一14b载体上,胞内 段构建于带有GsT标记的pGEx一KG载体上。 (2)以1~oFL终浓度IPTG诱导表达,在变性条件下以Ni2+~N丁A 亲和树脂进行纯化,获得大量变性RAGE胞外段融合蛋白,进 而进行了复性。 (3)以0.1~oFL终浓度IPTG诱导,同时在降低温度、适当延长 时间的条件下进行表达,在非变性条件下以Niz+~NTA亲和树 脂进行纯化,获得少量可溶性RAGE。 (4)以1~。比终浓度印TG诱导表达,Glutautione SuP翻ow亲 和树脂进行纯化,获得大量可溶形式的RAGE胞内段GST融 合蛋白。 2.sRAGE对人脐静脉内皮细胞(human umbUieal vein endothelial cells,RUVEC)IL一8基因表达与蛋白合成的阻断作用 (1) AGE一HSA对HIJvEc分泌IL一8的作用 AGE一HsA作用的剂量关系:内皮细胞接种在%孔培养板 上,在无血清培养基中静止12h?


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