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脂质微泡的制备及血小板受体靶向微泡构建的初步研究

区文超  
【摘要】:研究背景: 随着超声微泡造影剂和超声成像技术的不断开发,超声造影技术逐渐走向临床。同时,随着人们利用声学造影剂对心肌微血管功能、炎症的诊断和载药、载基因微泡研究的开展,人们逐渐认识到声学造影剂在疾病诊断和治疗领域具有更加广阔的应用前景。微泡在超声作用下发生非线性谐振,导致微泡破裂并辐射出能量。在这过程中,可能把微泡内包裹的药物或基因传输到组织中特定的部位。这种作用机制提示人们可以利用微泡来作为靶向治疗的工具。研究发现脂质微泡具有良好的组织相容性、高效的基因传输效果及柔韧易于表面构建的外壳,使它可能成为最有希望的靶向治疗有效载体。因此,脂质微泡成为研究的热点。目前国外已有几种脂质微泡研究成功,国内仍是空白。本实验室历经十数年,先后开发出“东冠注射液”、“全氟显”等白蛋白外壳的声学造影剂,其声学活性在许多方面优于国外同类产品。白蛋白微泡的探索成功成了本研究小组研究开发新一代声学造影剂——脂质微泡的动力。同时,分子成像技术在现今所有的无创医学影像领域竞相开展,尤其在核磁共振成像中发展较快。如同超声一样,早期的核磁共振造影剂也是非特异性的,只能暂时的、被动地在肿瘤或器官中集聚。近年来人们已成功地研制出能够靶向特定抗原部位的造影剂,能够集聚在特定的部位,提高MR的分辨率。同样,脂质超声微泡造影剂的研究成功,使得人们可以在微泡表面装配各种配体,使微泡聚集在病变部位,有可能实现无创、价廉、有效的靶向诊断、治疗梦想。 研究目的: 探索制备稳定脂质微泡造影剂的方法,开发新一代脂质微泡造影剂。 构建能够定向粘附血小板受体GPllb/ma的特异性靶向微泡,摸索微泡 表面构建的方法,探讨动脉微血栓超声分子成像的可能性。 研究方法: 1.以胆固醇、卵磷脂为原料制备脂质体,经葡萄糖溶解后成脂质体乳液, 以1 10w能量声振成脂质微泡。比较添加辅料聚乙二醇(mPEG)和增 加葡萄糖浓度后时间、温度对脂质微泡稳定性的影响。 2.以东冠注射液和全氟显作比较,评价自制脂质微泡左室及心肌的显影 效果。经股静脉弹丸注射不同剂量的三种造影剂,剂量设置为:极高 (0 .225mUKg)、高(o.15m叮Kg)、中(0.lm叮Kg)、低(0.osm叮Kg)、 极低(0 .025m班堪),全氟显只设极低剂量组。比较造影前后左室腔显 影等级、显影时间、左室内膜边界增强节段数及心肌显影情况。 3.RGDS片断(舫g~Gly一AsP一Ser)与PEG反应生成PEG一RGDS,与脂质 体溶液混合,经声振后制备成对血小板GPllb/ma受体有特异性亲 和作用的靶向微泡,观察其对血小板聚集形成的微血栓的粘附效应。 另在体外制作人工血栓模型,在二维超声下观察靶向微泡造影剂对声 学信号的影响。 4.在全血中加入ADP以激活血小板GPll b/ma受体,加入靶向微泡或 普通脂质微泡,用流式细胞仪检测CD41、CD61的表达量。研究靶向 微泡与血小板受体GP nb/ma表达的关系,探讨靶向微泡与活化受体 的结合能力。 结果: 1.制备的脂质微泡浓度1 .25又1护个/nil,直径3.745士4.7娜。随着脂质体 溶解液中葡萄糖浓度增高,脂质微泡稳定性明显增加。在不添加其他 辅料的条件下,以20%葡萄糖作溶解液微泡稳定时间明显长于5%、 10%葡萄糖组。但继续增高至30%,稳定时间并不继续延长。脂质体 溶液中加入mPEG5000后,微泡稳定时间显著延长,由不到一天延长 到将近一周。低温保存微泡稳定性较好。 2.随着剂量增加,脂质微泡左室显影强度、节段增强数及显影时间都增 加。中等剂量组的显影效果与全氟显极低剂量组相似,但显影时间仍 较全氟显短。脂质微泡在极低剂量组和低剂量组右室显影好,但左室 显影较淡;东冠注射液只在高剂量组和极高剂量组可见左室显影,极 高剂量组显影效果与脂质微泡中剂量组相似,但显影时间较脂质微泡 短。脂质微泡心肌显影只在极高剂量组较明显。 3.血小板聚集后加入经构建的靶向微泡,最后粘附在血小板微血栓周围; 而加入普通微泡的对照孔则未见这种粘附效应。体外血栓模型中,未 加微泡的血栓超声图像周围边界模糊,加入靶向微泡后血栓图像边界 明显增强。 4.全血中加入ADP后CD41、CD61表达显著增加,加入靶向微泡后表 达明显减少,而普通脂质微泡对受体表达无影响。 结论: 1.用含普通胆固醇、卵磷脂的脂质体作基本原料可以制备直径小于5“In’ 相对稳定的脂质微泡。添加PEG可能是制备稳定脂质微泡关键技术之 一。适当提高溶液中葡萄糖浓度有助于脂质微泡稳定。低温保存有利 于脂质微泡稳定。 2.以胆固醇、卵磷脂为主要成分的脂质壳含气微球能实现左室及心肌 显影,有望开发出新一代的心肌声学造影剂。自制脂质微泡显影效果 优于东冠注射液,但逊色于全氟显,约为其显影效果的1/4。 3.血小板受体特异性靶向微泡对血小板聚集形成的微血栓有明显的趋 附作用,有助于实现超声分子成像。血小板受体特异性靶向微泡能够 增强血栓的超声信噪比,对血栓的临床诊断有潜在的意义。 4.以RGDS作为导向连接臂构建


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