小鼠STO细胞植入无免疫抑制成年大鼠肝脏的异种移植研究

【摘要】：目的：我们将建株于正常成年“大鼠”肝脏的肝始祖细胞(LPCs)3(8)#21-EGFP经脾脏植入二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)缺失的德国Fischer 344实验大鼠肝内，以诱导并探明LPCs在体内多向分化的潜能。 方法：该实验动物模型的一个最大益处是：DPPⅣ阳性的供体细胞很容易在受体DPPⅣ阴性的背景下被检测出来。理论上受体大鼠DPPⅣ的缺失发生在蛋白质翻译阶段，因为在转录阶段仍可以检测到正常的3.3及5.6-kb信使RNA。为了追踪的便利，我们还同时将增强绿色荧光蛋白(EGFP)与新霉素抗性基因(neo~R)通过逆转录病毒导入供体细胞。 结果：初期的体外实验表明，LPCs在特定的诱导培养条件下，能够向肝系分化并表现成熟肝脏细胞与胆管细胞某些特性。然而，当我们成功地进行了第一轮体内实验，在受体肝脏内找到了存活并已向肝系分化的LPCs的同时，开始发现供体“大鼠”3(8)#21-EGFP细胞核型异常，并与培养体系中源于“小鼠”的滋养细胞STO核型相似(STO建株于小鼠胚胎细胞)。此后，经过一系列大鼠及小鼠特异性基因分析，确认该株“大鼠”LPCs细胞实际上来源于经γ射线照射后存活的“小鼠”滋养细胞STO。因此，为了消除γ射线照射，EGFP及neo~R逆转录外源DNA可能带来的实验误差，在第二轮体内实验中，我们直接将未经γ射线照射，未经基因工程改造的“小鼠”STO细胞经脾脏植入DPPⅣ缺失的德国Fischer 344“大鼠”肝内。与第一轮体内实验相似，第二轮实验亦未使用任何免疫抑制剂。结果发现异种植入物STO细胞经脾快速入肝；四周后，1％的入肝细胞长入肝实质，形成胆小管，并共表达DPPⅣ，葡萄糖六磷酸酶(G-6-Pase)及胆小管ATP酶(ATPase)。在整个12周的实验阶段中，我们在不同的时间点抽取标本，标本经过PCR，RT-PCR，SOUTHERN印记杂交及cDNA序列分析，均发现“小鼠”特异性的线粒体细胞色素C氧化酶1(COX1)DNA及白蛋白信使RNA，证实了异种移植物的存活及分化。 为了排除受体DPPIV缺失可能带来的实验误差，在第三轮体内实验 中，3(8)# 21一EGFP及sTo以相同的实验方法在未使用免疫抑制剂的情 况下植入DPPIv阳性野生型Fiseher 344大鼠。4一9周后，同样检测到 “小鼠”CaY7 DNA。在所有的体内实验中，空白对照标本及供体细 胞DNA植入标本均为阴性。 结论:基于(1)供体细胞在体外培养中，于对数生长初期不表 达，而在对数生长后期表达肝细胞标志物DPPIv与G一6一Pase;(2) 供体细胞不表达小鼠主要组织相容性(MHc)I类H一ZKQ，H- ZDQ/LQ，H类I一A抗原;不表达大鼠MHcl类RT IA抗原;且经Y干扰 素诱导后亦未表达MHC抗原;(3)上述体内实验结果;我们认为: “小鼠”STO细胞不仅能够越过异种MHC障碍，在Fiseher 344大鼠 肝脏内存活;而且具有向肝细胞系方向分化的能力。