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VEGF在慢性创面愈合中的作用及机理研究

彭湃  
【摘要】:慢性创面是整形外科临床工作中经常遇到的难题之一,常见的类型有压力性溃疡、静脉淤滞性溃疡、糖尿病性溃疡等。由于对其致病机理、影响因素等方面的了解不够深入,至今尚无一种满意的临床治疗方法。近年研究表明,生长因子作为一种分子信号调控细胞的增殖、分化、迁移与代谢,其表达与调控在慢性创面愈合中起着很重要的作用。而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是生长因子家族中最强的促血管内皮细胞有丝分裂原,作为血管生成的一个重要的调节因素,它在慢性创面愈合研究中占据着特殊的地位。在慢性创面,由于VEGF表达较正常创面下调而导致的血管生成的下降,被认为是慢性创面难愈合的重要原因。外源性VEGF的应用方式主要有蛋白注入和基因转染两种。由于VEGF蛋白存在价格昂贵、在体内半衰期短易水解、单次较大剂量应用可能会导致血流动力学改变等缺点,故蛋白注入给药方式具有较大的局限性。近年来随着基因转染技术的飞速发展,VEGF转基因治疗成为一种使其在局部持续发挥作用的有效方法。目前国内外文献报道VEGF转基因治疗多见于缺血性疾病如肢体缺血、心肌缺血以及皮瓣成活率等方面的研究,而在慢性创面的应用研究尚未见明确报道。 基于这种思路,本实验改进了传统的兔耳缺血创面模型,并采用新型材料纳米微囊为载体包裹VEGF质粒,通过基因转染方式促进了兔耳慢性创面的愈合,并对其作用机理进行探讨,以期为临床治疗慢性创面提供新的思路和理论依据。实验共分五部分: 第一部分:创建慢性创面模型。选用健康新西兰白兔8只,分为老龄组(48~60月龄)4只,作为改进型慢性创面组;年轻组(3~6月龄)4只,作为传统缺血创面对照组。结扎兔耳中央动脉及头侧动脉,保留尾侧动脉及全部静脉,同时在每侧兔耳腹侧软骨表面制作三个直径6mm的圆形创面,刮除软骨膜。于术后3,6,9,12d在老龄兔耳根部多次行环切术,充分阻断血运。连续观测兔耳皮温、静脉氧分压变化,采用显微测微尺镜下测量术后14d时创面横断面新生上皮间距EG、肉芽组织间距 第一军医大学博士学位论文 GTG及肉芽组织最大厚度PH。结果显示:①各组皮温及氧分压在术后 各时间点与术前比均有显著差异,P0 .01。3d后每一时间点,两组皮温 及氧分压比较均有统计学意义,P0.01,老龄组数值显著低于年轻组。② 老龄组EG及GTG较年轻组分别增加了72%、67%,有统计学意义, P0.01;PH减少了6%,P.05。 第二部分:纳米微囊一VEGF复合体体外转染试验。采用新型非病毒 纳米微囊(NanosPhere)载体转染人VEGF165,并与阳离子脂质体转移方 法进行比较,研究新型非病毒纳米微囊载体的可行性、安全性、转染效 率,为进一步应用于动物实验提供依据。以VEGF165为目的基因,构建 真核表达载体peDNA3 .1加以c一hisA一vEGF165,分别利用纳米微囊、阳离 子脂质体介导vEGF,。5转染鼠成纤维细胞(3 Yl),镜下观察细胞转染后表 型变化;通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率;ELISA检测经 G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况;West曲Blot检测基 因表达水平;MTT法检测对细胞的毒性。结果显示:经G418筛选后的 阳性细胞克隆,为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型。Westem Blot及 ELIsA结果显示纳米微囊转染3YI细胞48小时后培养上清中有VEGF 蛋白表达,3一5天达到峰值。免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相 应浓度的阳离子脂质体。 第三部分:纳米微囊一VEGF复合体基因转染对慢性创面愈合的影响。 选用健康新西兰老龄白兔8只,制作慢性创面模型,另在每侧兔耳制备 一个相同大小的非缺血创面作对照。实验分三组:Cw+v EGF组(慢性 创面滴加纳米微囊一VEGF复合体)、CW组(慢性创面滴加空载质粒)、 N丫V组(非缺血创面滴加空载质粒)。通过大体观察及术后14d镜下显微 测量得出结果:①CW+VEGF组及NW组创面肉芽及上皮生长明显快于 CW组。②HE染色显示CW十VEGF组及NW组肉芽组织丰富,而CW 组肉芽增生缓慢。③新生上皮生长NEG:三组之间两两比较均有统计学 意义,P0.05。与CW组相比,CW十VEGF组增加了165%;NW组增加 了249%。肉芽组织最大厚度PH:三组之间两两比较均有统计学意义, P0.05。与CW组相比,CYV十VEGF组增加了70%,NW组增加了46%。 肉芽组织体积NGTV:CW+VEGF组与N丫V组无明显差异,但与CW组 比较有统计学意义,P0 .05。它们分别增加了317%、302%。 第一军医大学博士学位论文 第四部分:VEGF及受体KDR在慢性创面中的表达及意义。健康新 西兰老龄白兔25只,动物模型制作同第三部分。于术后1d、3d、7d、 10d、14d分别取材。采用RT门pcR、免疫组化、微血管计数、细胞外基 质特殊染色、图像分析等实验方法,测定各组创面在不同时间点vEGF、 KDR表达变化以及创面微血管、细胞外基质(ECM)的变化情况。结果 表明:①盯.PCR测定结果,VEGF mRNA在N飞V和CW十VEGF组3d后 的表达水平均高于其在CW组相应时间点的表达水平,具有统计学意义, P0.05。KDRn正NA在N、v和Cw+v EGF组3d后的表达水平均高于其 在CW组相应时间点的表达水平,其中在NNV组7d至14d,CW+VEGF 组3d至14d的表达水平与其在Cw


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