供者NK细胞在小鼠MHC半相合骨髓移植的作用

【摘要】：异基因造血干细胞移植(alloHSCT)是治疗恶性血液病的有效手段，完全相合的供者越来越少，迫使人们研究HLA半相合供源的干细胞移植。与HLA全相合比较，HLA半相合HSCT有良好的杀伤肿瘤效应。然而，HLA半相合HSCT发生移植失败和移植物抗宿主病(GVHD)的比例也相应增加。新的研究定位点是在保留半相合HSCT移植物抗白血病(GVL)的前提下，如何降低GVHD，减少移植并发症，提高移植后受者生活质量。目前采用的去除T淋巴细胞、筛选干细胞移植物和加大免疫抑制剂的用量，不能满足上述标准。新的研究方向转移到了采用免疫细胞进行调节。NK细胞具有杀伤肿瘤、抗感染的能力，但在半相合HSCT中的移植免疫调节的确切作用还不清楚，本研究在C_(57)BL／6~(H-2b)→CB6F_1~(H-2b/d)小鼠骨髓移植模型上观察供者NK细胞在半相合骨髓移植中的作用，为临床在半相合骨髓移植中应用NK细胞提供实验依据，确立NK细胞的免疫调节作用，将会使92％以上的患者得到移植治疗。 实验方法 一、供者NK细胞在小鼠MHC半相合骨髓移植造血重建及免疫耐受的研究： 制备CB6F_1~(H-2b/d)小鼠为受者，C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠为供者。90只CB6F_1~(H-2b/d)小鼠经9.0Gy照射后随机分为9组，每组10只。对照组(共4组)：对照1组为单纯照射组；对照2组为半相合骨髓细胞移植组；照射后4h移植C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠骨髓细胞；对照3组为同基因骨髓细胞移植组：照射后4h移植CB6F_1~(H-2b/d)小鼠骨髓细胞；对照4组为半相合GVHD对照组：照射后4h移植C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组(共5组)：实验1、2、3组为CB6F_1~(H-2b/d)小鼠在照射后1h内首先移植纯化 第一军医大学博士学位论文 的c57BLz6H-2b小鼠NK细胞，剂量分别为1 x 10今只、5 x 105/只和2 xlo今 只，在照射后4h移植Cs尹L/6H一小鼠骨髓细胞;实验4、5组为照射后 1h内分别移植C57BL/护一小鼠NK细胞1 xlo今只、5 x 105/只，在照射 后4h移植CS尹L/护一小鼠骨髓细胞和脾细胞。以血象、体重、生存期和 病理组织学变化为观察指标并作组间比较。 二、供者NK细胞抗白血病作用的体内研究: 建立荷EL%11(H一Zd)红白血病细胞的cB6FIH一小鼠动物模型， 30只红白血病小鼠随机分为5组，每组6只。对照组(共3组):对照1 组为未治疗组;对照2组为阿糖胞昔治疗组:小鼠注入EL9611(H一Zd) 细胞后第5天开始腹腔注射阿糖胞昔50m留(kg·只)X6d;对照3组为同 基因NK细胞治疗组:注射EL9611(H一Zd)细胞后第5天每只小鼠输注 eB6FIH一小鼠NK细胞1又一06/只x ld。实验组(共2组):实验l、2 组为注射 EL9611(H一Zd)细胞后第5天每只小鼠输注Cs7Bu护一小鼠 NK细胞，剂量分别为2 x 105/只xld、5 xlo今只xld。以血象、体重、 生存期和病理组织学变化为观察指标并作组间比较。 三、供者NK细胞对小鼠半相合骨髓移植的GVHD与GVL的作用: 建立荷EL%11(H一Zd)红白血病细胞的cB6FIH一小鼠动物模型， 5天后随机分为7组，每组10只，移植组在gGy照射后行Cs7BL/护-2b 一cB6FIH~方向骨髓移植。对照组(共5组):对照1组为未治疗组; 对照2组为单纯照射组;对照3组为阿糖胞昔治疗组:小鼠腹腔注射阿 糖胞昔50mg/(kg·只)X6d;对照4组为单纯骨髓细胞移植组:小鼠照射 后4h移植C57BL/6H-2b’J、鼠骨髓细胞;对照5组为GvHD对照组:小鼠 照射后4h移植CS尹u6H一小鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组(共2组): 实验1组，照射后输注CS旧u6H-2b小鼠NK细胞1 x 10今只，4h后移植 C57BL/护一小鼠骨髓细胞;实验2组:照射后同实验1组，4h后移植 C57Bu6H-Zb小鼠骨髓细胞和脾细胞。以血象、体重、生存期和病理组织 学变化为观察指标并作组间比较。 四、供者NK细胞促进小鼠半相合骨髓细胞植入: 制备cB6FIH一确小鼠为受者，C57BL/6H一小鼠为供者。60只小鼠根 据不同照射剂量及不同NK细胞输注量分为10组。对照组(共6个组): 对照1、3、5组均为单纯照射组，照射剂量分别为gGy、7Gy、6Gy;对 6 第一军医大学博士学位论文 照2、4、6组均为半相合骨髓细胞移植组:照射后4h移植骨髓细胞，照 射剂量分别为gGy、7Gy、6Gy;实验组(共4各组):实验1、3组，照 射后lh内移植Cs7Bu护一小鼠NK细胞1 x 10今只，4h后移植C57BL/6H一2b 小鼠骨髓细胞，照射剂量分别为7Gy、6Gy;实验2、4组，照射后lh 内移植e57BL/OH一b小鼠NK细胞5 x 105/只，4h后移植e57BL/6H一小鼠 骨髓细胞，照射剂量分别为7Gy、6Gy。以血象、生存期和嵌合体比例 为观察指标并作组间比较。 实验结果 一、供者NK细胞在MHC半相合骨髓移植造血重建及免疫耐受的 研究: 1.生存期:在半相合移植模型上证实，对照1组为(5.巧士0.66)d， 对照4组为(15.80士1.93)d，其他组小鼠生存期均大于3Od: 2.病理学结果，对照4组出现典型的GVHD病理表现，其他各组 均无GVHD病理表现; 3.移植后+10d时白细胞及血小板计数:对照2组WBC为 (0.9妊0.22)x 109几、PLT为(61.肚7.27) x 10玩。实验1、2、3组 wBe计数分别为(2.01士0.21)x log/L、(1.95切.29)xlog/L、(1.97土0.21) 、log/L;PLT计数分别为(101