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霍乱弧菌检测芯片的研制

王洪敏  
【摘要】:霍乱弧菌是霍乱的病原菌。霍乱可以引起爆发、流行、大流行,严重危害人民健康,甚至社会安定。霍乱在南亚地区流行了至少上千年。自1817年以来,霍乱发生过七次世界大流行。历史上霍乱的七次大流行的病原菌,前6次是古典型霍乱弧菌,第七次是埃尔托型霍乱弧菌。1992年10月,一种被称为O139型的新型霍乱弧菌首次袭击印度大陆,引发了典型的霍乱爆发。一些专家指出,O139型霍乱弧菌很可能会引起第八次世界性霍乱大流行。 霍乱弧菌快速准确的检测,对于自然流行的监测与预防,具有重要意义。 20世纪90年代新出现和发展起来的基因芯片技术,是近年来在生命科学领域内兴起的一项高新技术。而用基因芯片检测霍乱弧菌的方法,迄今为止,世界范围内均末见公开报道。 为了成功地研制一块应用型的霍乱弧菌基因检测芯片,以λ噬菌体全基因组DNA模拟病原体霍乱弧菌的一个靶区域,试验性地对霍乱弧菌检测芯片探针的制备方法、样品的标记方法和芯片的杂交条件等进行了探索和优化。通过多种方法的试验和筛选,找到了一个简便有效的电泳条带的大规模批量回收转移方法,即牙签插胶法;在芯片探针制备的探索中,摸索出了一个简化的大规模地制备探针的方法,即GIN-PCR法。 从转化了含有λ噬菌体全基因组DNA的Sau3AI酶切片段的T-载体质粒的平板上,共随机地挑选了697个阳性白色克隆进行第一次PCR克隆鉴定。最后经过第二次PCR收集探针,共收集到394个Tarp探针,探针收集的成功率为56.5%。打印了一个含381个Tarp探针,4个阴性对照,7个空白对照和4个边角定位,共396个样品的λ噬菌体全基因组DNA微阵列。用此芯片进行的杂交实验显示,当芯片打印液中探针的浓度高于325 ug/mL时,平均信号强度已基本达到饱和。芯片扫描图中所显示的探针杂交信号均匀、稳定、饱满,完全符合检测分析的要求。 同时,利用建立的λ噬菌体全基因组芯片平台,成功地建立了一个快速基因芯片检测法。该检测法仅需要一小时样品酶切,一小时接头连接,两小 霍乱弧菌检测芯片的研制 时PCR样品标记和一小时芯片杂交,便可以在一个工作日即8小时内完成从 新鲜样品的DNA提取开始到获得芯片检测结果的全部检测操作。 库霍丛弧直基酗攀坦叮趾与致鱼哪兰鲍些鲤缝擎里奥替即 一皿基旦鱼鱼塑巡里塑塑和巡垦暨鲤鲤坚粤。用0“gO软件设计的 LA一PCR引物对CTX一U/CTX一L和vPI一U/VPI一L,通过LA一PCR的方法,成功地 扩增出了预期的CTX基因元件上的大小为7019bP的DNA片段和VPI上长 19246bp的片段。以这两个霍乱弧菌特征性的DNA片段,利用GIN一PCR和Tarp 探针制备法,分别制备一个含110个样品, r一一一一一一一 通至剑醒翅巫鱼塑迎鱼坦孟一. 进鲤塑卫梦。 和一个含 190 个样品 用于检测霍乱弧菌的VPI致病性岛 的DNA亚阵列。最后将这两个亚阵列(sub一array)集合在一块芯片上,形成一 一一-一~~一一~~~~~~ J洗斟汉连巡遥鲤堕鱼些进生 芯片与非霍乱弧菌 翅罐鱼业壑睑姐夕达趣迅鲤吐里剑丝 基因组DNA样品, 组探针。第一组: 鲤通鲤夔夔鲤里绝糙鱼缈最终亚立工西 的探针;第二组: 几、~~一~~~~一一~一~ 用于鉴定霍乱 弧菌带毒的大流行株的特异性探针。 用上述通过霍乱弧菌标准株确定的检测探针,来试验性地检测了10个经 过鉴定确认的霍乱弧菌样品,其中包括9个致病性流行株和一个无毒性的野 澳.株。检测结果初步说明,班剑的洲霍丛西菌_T旦rP捡测莎片可成功地用于霍乱 弧菌样品的检测,并确定被检测样品的带毒情况。 》‘盔~=~一一二二二,~=赴、一一一一.下二二二‘一刁曰、训决护灿~一~,~一一=一一 对同一样品用常规和快速 两种检测法检测的结果进行比较,除了快速检测法的信号较弱外,芯片扫描 鱼塾鲤噜和丝果缎读型鲤垦肇 俞该冠改进俞丽巍丽忍一夏 一二一二二二二二丁二二=,户一一一一卜 ,鲤里趾孽孟L呱菌的一恤p誉片的{呼检测。 综上所述,塑些望鱼塑产燮塾鱼丝二上塑壁迪些 片制备技术和一个改进的芯片检测方法。利用这些方法,成功地研制了一块 霍乱弧菌检测芯片。经过试验性样品杂交检测,结果证实, 丽骊瘾鲡丽畜一 尸一-一一一一一~一一一一 Tarp检测芯片可成功地用于霍乱弧菌样品的检测,并确定被检测样品的带毒 情况。在这个课题的研究实验过程中,还创新了具有推广价值的技术方法。 广一一2夕


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