恒河猴骨髓间充质干细胞的定向分化及其机制

【摘要】：肌腱损伤是外科临床的常见疾病，目前尚未有理想的治疗方法。肌腱组织工程研究为临床修复肌腱损伤和缺损提供了新思路。肌腱细胞分化程度高，体外增殖相对缓慢，不能满足肌腱组织工程对其数量上的要求。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不但能保持自我更新的能力，而且还具有多向分化潜能。在特定条件下，可以向多种组织细胞分化。另有研究表明，异体骨髓MSCs移植不引起宿主的免疫排斥反应。因此，MSCs有可能成为肌腱组织工程中很有吸引力的种子细胞的来源之一。 本研究通过贴壁筛选法结合MSCs专用培养基MSCGM从非人灵长类动物恒河猴骨髓中分离、培养骨髓MSCs，建立体外培养扩增骨髓MSCs的方法；应用免疫组织化学和流式细胞术等手段检测所分离细胞的碱性磷酸酶活性、细胞表面抗原标志、细胞基质蛋白属性；采用排除法对所离的细胞进行鉴定，并将所分离细胞接种于裸鼠体内观察其多向分化潜能；应用原位杂交法检测MSCs的端粒酶活性；通过基因转染方法将外源基因BMP12导入骨髓MSCs中，诱导骨髓MSCs定向分化为腱细胞；通过Western Blotting检测BMP12基因导入后的MSCs内信号蛋白分子Smad4的表达变化，初步探讨骨髓MSCs定向分化为腱细胞的机制。 结果表明，本研究成功地建立了体外培养扩增骨髓MSCs的简单、稳定、高效的方法。MSCs的细胞周期和生长曲线提示所分离的MSCs具有较强的增殖潜能；免疫组织化学和流式细胞术检测证实了所分离的细胞为未分化的骨髓MSCs，而且细胞的均一性较好，纯度较高；原位杂交法证实了MSCs具有较高的端粒酶活性；裸鼠体内实验表明所分离的MSCs具有多向分化的能力；通过基因转染的方法将外源基因BMP12 恒河猴骨髓间充质干细胞的定向分化及其机制 导入骨髓MSCs中，成功地诱导了骨髓MSCs定向分化为腔细胞;通过 形态学观察、RT一PCR和流式细胞术检测显示，诱导后的细胞表型发生明 显改变，具有与键细胞相似的表型特征，而且诱导后的细胞仍保持较强 的增殖能力;westem Blott吨结果提示，BMP12诱导骨髓Mscs定向分 化为健细胞过程中，Smad通路参与了此过程。综上所述，骨髓MSCs 是一种很有前途的肌键组织工程的种子细胞