恒河猴间充质干细胞诱导分化成骨细胞复合PDLLA/PLA-PEG-PLA嵌段共聚物支架修复颅骨缺损

【摘要】：目的 体外分离培养非人类灵长类动物恒河猴骨髓MSCs，研究其生长、扩增及诱导分化为成骨细胞的特性；运用MSCs定向分化的成骨细胞评价PDLLA、BG、β-TCP与PLA-PEG-PLA三嵌段共聚物组合成的6种新型组织工程支架的细胞相容性，筛选出较好的细胞支架；研究比较筛选支架与成骨细胞复合构建的组织工程人工骨修复恒河猴颅骨缺损的效果，评估PDLLA／PLA-PEG-PLA在骨组织工程中的应用前景。 方法 1．梯度离心法分离、纯化恒河猴骨髓源MSCs，观察不同接种密度和换液时间对细胞生长的影响；在体外应用成骨添加剂(含地塞米松10~(-7)mol／L、β-甘油磷酸钠10mmol／L、维生素C50mg/l)或rhBMP-2(100ng／L)定向诱导分化，对分化后的细胞进行免疫组化染色和ALP、BGP定量测定以鉴定成骨细胞，并比较两种定向诱导分化方法的效果。 2．溶剂流延-颗粒沥滤法制成高孔隙率PDLLA、PDLLA／BG、PDLLA／β-TCP、PDLLA／PLA-PEG-PLA、PDLLA／PLA-PEG-PLA／BG及PDLLA／PLA-PEG-PLA／β-TCP 6种新型可吸收性生物支架材料，体外与成骨细胞复合培养，倒置显微镜、扫描电镜、ALP染色及MTT法观察比较各种支架材料对恒河猴成骨细胞粘附、增殖的影响，以筛选出细胞相容性良好的支架材料。 ~._一~…~_”…__..……羊:兰多叁兰叁壑竺三士塑生壑塑二一一一一 3.在4只恒河猴双侧顶骨24个10nun颅骨去骨膜全层骨缺损中分 别植入4种筛选出的支架/成骨细胞复合体，术后6、12周采用X线、组 织学及扫描电镜观察评价骨缺损修复情况。 结果 1.梯度离心法分离、纯化得到的恒河猴骨髓源MSCs具有分裂和克 隆增殖的能力，种植细胞密度为10x 104~30x 10勺c时，48h后半量换液， 以后每3天全量换液的方法较合理，MSCs能少量表达ALP活性，分泌 的钙量较少;诱导分化后的细胞具有和体内成骨细胞相同的形态学特征， ALP染色阳性，能表达I型胶原，不表达n型胶原，细胞融合后3d，ALP 和BGP分泌明显增加，融合后14d细胞ALP、BGP的分泌水平略有升 高，但无明显增加;采用成骨添加剂和rhBMP一2诱导分化MSCs后相同 时期成骨细胞ALP活性、BGP含量无明显差异。 2.采用溶剂流延一颗粒沥滤法能制备白色泡沫状可降解材料，具有 孔洞均匀分布、孔间高度交连的三维结构，孔径200一300 pm，孔隙率 为90%左右。 3.倒置显微镜、扫描电镜、ALP染色显示成骨细胞在PDLLA、 PDLLA/PLA一PEG一PLA、PDLL刀p一TCP及 PDLLA/B G4种材料上能良 好粘附、增殖，并向内部生长，而在PDLL户以pLA一PEG·PLA/BG、 PDLLA/PLA一PEG一PL户以p一TCP两组材料上粘附差、细胞逐渐死亡;MTT 法结果显示PDLL户以PLA一PEG一PLA、PDLL刀p一TCP及PDLL户以BG细胞 活性优于单纯PDLLA支架，其中PDLL户JpLA一PEG一PLA最佳。 4.组织工程人工骨植入骨缺损后，都未引起动物明显的全身反应， 局部切口愈合良好。X线、组织学及扫描电镜均证实组织工程人工骨在 术后6w、12w成骨能力明显高于空白对照组，也高于单纯注射成骨细胞 第一军医大学大学二零零一级博士学位论文 对照组，而改性的PDLL户以PLA一PEG一PLA、PDLL刀p一TCP及PDLLA/BG 成骨能力优于单纯PDLLA，X线评分证实PDLLA/pLA一PEG一PLA成骨 能力最强，12周时成骨量达缺损区70%。 结论 1.密度梯度离心法分离得到的非人类灵长类动物骨髓源MSCs，体 外培养具有分裂、克隆增殖的能力，在加有成骨细胞诱导剂或rhBMP一2 的培养基里能诱导分化为成骨细胞，化学药物在定向诱导分化过程中具 有和生长因子相一致的作用。 2 .PDLLA、PDLL户以PLA一PEG一PLA、PDLLA/BG及PDLLA/p一TCP 4组材料能与成骨细胞良好粘附，具有良好的细胞相容性，而 PDLLA于LA一PEG一PLA/BG、PDLL户以PLA一PEG一PL刀p一TCP两组材料细 胞粘附性差，且有一定的细胞毒性。PDLL户“pLA一PEG一PLA增加了材料 的亲水性，促进了成骨细胞的粘附、增殖能力。 3.四种筛选的支架与成骨细胞复合构建组织工程人工骨具有较强的 体内成骨效能，其中PDLLA/BG、PDLL刀p一TCP成骨能力优于PDLLA， 而PLA一PEG一PLA的加入能最大程度地促进多孔PDLLA在骨缺损修复中 的骨传导能力，提高了骨生成的质量。PDLL户“pLA一PEG一PLA在骨组织 工程中有很好的应用前景。