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用LMP1构建重组慢病毒载体及建立转基因小鼠模型

杨玉芳  
【摘要】:EB病毒与多种人类肿瘤相关,尤其与鼻咽癌密切相关,但由于缺乏实验动物学方面的证据,EB病毒在鼻咽癌的发生、发展中所起的作用一直是研究的热点。但至今尚未能用EB病毒或其致瘤基因建立鼻咽癌动物模型,分析原因,我们认为主要与没有利用鼻咽组织相对特异性启动子有关。为了解决这一问题,本研究利用嗜上皮细胞特异性启动子ED-L2,携带增强型绿色荧光蛋白报告基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)与EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1),构建融合蛋白基因载体。本研究拟分别构建ED-L2-EGFP慢病毒表达载体、ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒表达载体、ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒表达载体;将EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的基因,通过显微注射技术,建立携带靶基因的转基因小鼠,为进一步建立鼻咽癌动物模型探索新途径。 研究内容及结果如下: 一、成功构建了ED-L2-EGFP慢病毒载体、ED-L2-N-LMP1-EGFP慢病毒载体、ED-L2-B-LMP1-EGFP慢病毒表达载体 以pED-L2-N-LMP1质粒为模板,通过PCR法扩增ED-L2启动子序列,上游5′端引入PacI酶切位点,下游5′端引入BamHI酶切位点,PCR产物胶回收纯化与pUC118载体16℃进行连接。利用基因重组技术,首先将ED-L2启动子序列克隆入慢病毒载体,然后分别将N-LMP1及B-LMP1克隆入含ED-L2启动子的慢病毒载体中。抽提质粒,重组载体酶切鉴定、基因测序,选 取正向插入克隆用于下一步研究。 二、重组载体体外转染实验重组载体分别转染5一8F、6一10B、CNEI、 293T细胞,在倒置荧光显微镜下观察,可见绿色荧光蛋白表达,说明载 体构建成功。提取转染细胞总RNA,通过RT一PcR检测,可见LMPI基 因表达。转染细胞免疫组织化学检测为阳性,证明LMPI基因在癌上皮 细胞水平有转录及蛋白质表达。而转染鼠成纤维细胞NIH3T3,未见目的 基因表达。提示ED一LZ启动子能够有效引导靶基因在上皮细胞的表达。 三、慢病毒载体转基因小鼠模型的建立利用ED一LZ一N一LMPI一EGFP 慢病毒载体、ED一LZ一B一LMPI一EGFP慢病毒载体,分别与么8.9及水泡性 口炎病毒糖蛋白(v esieular stomatitis virus glycoprotein,vsvo)共同转染 293T包装细胞,转染后60小时,收集上清,超速离心,浓缩病毒。用 适量PBS重悬病毒,利用显微注射法,将适量病毒悬液注射入小鼠受精 卵细胞,将注射后成活的受精卵细胞移入假孕雌鼠输卵管壶腹部,得到了 3只ED一LZ一N一LMPI一EGFP慢病毒转基因小鼠。 本研究主要创新点如下: (一)首次将慢病毒载体、ED一LZ启动子、N一LMPI及B一LMPI有效 重组并成功构建了ED一LZ一EGFP、ED一LZ一N一LMPI一EGFP及ED一LZ- B一LMPI一EGFP新型慢病毒载体; (二)在细胞和分子水平对所构建的载体进行了验证并证明ED一LZ启 动子能有效引导靶基因在上皮细胞表达; (三)利用带有鼻咽部特异启动子及致瘤靶基因的重组慢病毒载体系 统和显微注射技术,建立了慢病毒转基因小鼠模型并获得3只ED一LZ 一LMPI一EGFP慢病毒转基因小鼠。 本研究为建立鼻咽癌可视化动物模型奠定了良好的实验基础


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